天然植物药是指用单一或多种植物配伍，含有专一活性成分和(或)植物提取物，用于医疗目的的医疗产品；其来源于天然植物产物。20世纪90年代以来，在世界范围内兴起了“回归大自然”潮流和“绿色运动”，天然植物药日益受到人们的重视和青睐。2005年，天然植物药销售额约占全球药品销售总额的30%，突破260亿美元，而且正以每年20%以上的速度在增长。因此，从植物中开发新药是世界新药研发的潮流和趋势。
巨噬细胞是免疫系统中的重要细胞，由骨髓造血干细胞分化发育而来。巨噬细胞的生物学功能广泛，在免疫反应的很多阶段发挥重要作用。主要包括：(1)加工处理提呈抗原、启动特异性免疫应答；(2)非特异性吞噬杀伤作用和活化后分泌毒性物质（H2O2，O-2和NO等）、抗微生物肽（防御素、阳离子蛋白等）及酶类（溶菌酶等）等产物发挥杀伤效应；(3)免疫调节作用：分泌细胞因子IL-1，IL-6，IL-8，IL-12和TNF-α等；（4）抗肿瘤作用。在免疫药理学的研究中，天然植物产物对巨噬细胞功能的影响正受到人们越来越多的关注，并有望从中开发出具有高效低毒免疫调节作用的新药。
现将目前国内外天然植物产物对巨噬细胞功能影响的研究进展综述如下：
1对巨噬细胞抗原提呈功能的影响
巨噬细胞具有抗原加工、提呈和免疫调节等作用，在机体特异性免疫应答中发挥重要作用。实验表明，南美柚木的提取物能够阻止小鼠实验性自身免疫性脑髓炎（EAE）临床症状的恶化，其活性成分是一些多酚聚合物，能够减少树突状细胞和CD4+T细胞的产生；尽管在数量上使巨噬细胞增加，但是能够减少其CD80和MHCII分子的表达。这些结果提示多酚聚合物对EAE的治疗作用与其抑制抗原提呈功能有关［1］。天花粉蛋白能够显著提高巨噬细胞IL-10和单核细胞化学引诱蛋白1(MCP-1)的表达，而降低IL-12和TNF-α的表达，具有诱导Th2细胞分化和IgE反应的作用［2］。雷公藤内酯醇可通过阻止THP-1巨噬细胞中CD80，CD86表达以及IL-12产生来抑制其抗原提呈功能［3］。
2对巨噬细胞吞噬作用的影响
巨噬细胞可吞噬消化异物、杀灭多种病原微生物，并吞噬处理机体自身衰老死亡的组织细胞，是机体非特异性免疫的重要因素。研究发现，施保利通是一种由侧柏叶、紫锥菊根等多种植物提取物组成的免疫刺激剂，可以显著促进肝脏巨噬细胞（枯否细胞）对红细胞的吞噬能力；其中侧柏叶主要影响其吞噬过程的第一阶段［4］。葫芦巴水提物可以显著提升巨噬细胞的吞噬指数和噬菌能力［5］。灵芝孢子多糖和灵芝破壁孢子多糖能增强腹腔巨噬细胞吞噬能力并促进TNF-α和NO分泌［6］。藏药忍冬果水提物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能有明显促进作用，同时能诱导巨噬细胞分泌IL-1及TNF-α，并促进细胞因子TNF-αmRNA和IFN-γmRNA的表达［7］。反之，雷公藤内酯醇则能显著抑制巨噬细胞的杀伤活性［8］。
3对巨噬细胞活性产物生成的影响
3.1NONO是一种重要的介质分子，参与机体的多种生理与病理过程，包括神经传递和炎症［9］；在免疫功能的调节中也起着十分广泛而复杂的作用。NO由NO合酶（NOS）催化L-精氨酸氧化成NO和L-瓜氨酸的反应而产生。实验表明，一种新型的雷公藤内酯醇类似物，(5R)-5-羟基雷公藤内酯醇〔(5R)-5-Hydroxytriptolide，LLDT-8〕，可以显著减少NO的产生和iNOS（诱导型NOS)的表达［10］。库拉索芦荟多糖则可显著促进正常巨噬细胞的NO生成，并抑制LPS激活的巨噬细胞的NO生成，对小鼠腹腔巨噬细胞NO的生成具有双向调节作用［11］。
3.2前列腺素E2前列腺素E2是炎症反应的重要介质。从西班牙草药Sideritisjavalambrensis分离出两种二萜类化合物，能够抑制小鼠腹腔巨噬细胞前列腺素E2的产生，从而起到抗炎作用［12］。
3.3溶菌酶溶菌酶是巨噬细胞合成并迅速释放到细胞外的一种重要水解酶，血清溶菌酶主要是由巨噬细胞合成和释放所致，其活性测定常用于反映吞噬系统的活化和功能。秃疮花提取物对诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生超氧阴离子(O-2)、提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力和溶菌酶水平均有显著性效果［13］。
3.4活性氧活性氧是指氧的某些代谢产物和一些含氧产物，包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、单线态氧、次氯酸、过亚硝酸盐等。前3种构成细胞中活性氧的主要产物。活性氧对细胞成份的破坏作用是氧化细胞的脂质成分及溶酶体和微粒体膜，通过氨基酸交链破坏蛋白质，还使某些酶类失活。实验证明，从苦味叶下珠植物中提取的一种阿拉伯半乳聚糖能够刺激小鼠腹腔巨噬细胞超氧阴离子的产生，但产生过程与NO途径无关［14］。远志的醇提物能够抑制LPS诱导的鼠巨噬细胞和人全血细胞炎性介质的释放，其主要成分木犀草素-7-葡萄糖苷是一种过氧化物、氢氧化物的清除剂，可以抑制LDL的氧化以及抑制人外周血单核细胞和多核中性粒细胞活性氧簇的产生［15］。
4对巨噬细胞炎性细胞因子产生的影响
常见的炎性细胞因子有：IL-1，IL-6，IL-8，IL-12，IL-15，IL-16，IL-17，IFN-γ，TNF-α，单核细胞化学趋化蛋白-1(MCP-1)，它们能促进炎症的发生和发展。天然植物产物里有些对炎性细胞因子的产生起抑制作用，有些起到促进作用，而有些则可起到双向调节作用。
4.1抑制作用研究发现：雷公藤内酯醇、黄芩苷［16］能够抑制人外周血单核细胞巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α，MIP-1β［17］，以及淋巴结细胞TNF-α等炎性细胞因子的产生，从而起到抗炎免疫抑制作用。当归报春花苷能够显著减少内毒素诱导的巨噬细胞晚期致炎细胞因子HMGB1的释放，起到治疗内毒素血症和实验性败血症的作用［18］。商陆皂苷甲在体内外实验中能够显著降低炎症细胞因子TNF，IL-1和IL-6的产生，从而起到抗炎作用［19］。来自灯笼草的玉米黄素是一种开环类固醇，玉米黄素B加上玉米黄素F或G，可以减少巨噬细胞产生NO，TNF-α，IL-6及IL-12；注射了玉米黄素B，F或G的小鼠能在LPS致死性剂量的攻击下存活，这些显示了开环类固醇是一类有效的免疫调节剂［20］。
4.2促进作用紫锥菊茎、根提取物能够刺激鼠巨噬细胞细胞因子（TNF-α，IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-10和NO等）的分泌以及显著增强人外周血单核细胞生存能力和增殖能力［21］。烷基酰氨是紫锥菊的一种活性成分，能够显著提高肺泡巨噬细胞噬菌活性以及吞噬指数，并且在体外实验中能够显著促进LPS刺激的肺泡巨噬细胞产生TNF-α和NO，有效地提高健康大鼠肺泡巨噬细胞功能［22］。抗肿瘤药Arglabin（一种从多花蒿植物中提取的倍半萜烯内酯）能够有效地诱导鼠巨噬细胞肿瘤细胞株J774.1分泌IL-1，TNF-α和IL-2，并且能增强其吞噬作用［23］。
4.3双向调节作用大黄素是大黄的有效成分之一，其一方面对过度炎症反应中TNF-α的分泌具有抑制作用，另一方面对机体正常免疫防御功能中TNF-α的分泌又有促进作用，发挥双向调节功能［24］。
5对巨噬细胞活化信号通路的影响
巨噬细胞上存在一类很重要的受体-Toll样受体，其是一类与天然免疫密切相关的受体家族，可对PAMP（指广泛存在于病原体细胞表面的分子标志）进行识别，引发的信号传导能导致炎症介质的释放，在天然免疫防御中起重要作用，并最终激活获得性免疫系统。因此，Toll样受体控制着由天然免疫向获得性免疫的转变。Toll样受体家族到目前为止共发现有10类受体，其中Toll样受体4（TLR4）可识别细菌的脂多糖(LPS)［25］。黄芪多糖（APS）能够激活B细胞和巨噬细胞（而不是T细胞），促进B细胞增殖和细胞因子的产生；且APS对巨噬细胞的活化可能是通过其作用于细胞表面TLR4分子介导的信号通路有关［26］。薯蓣碱通过TLR4信号途径诱导巨噬细胞活化，诱导骨髓细胞TLR4途径下游细胞因子的表达［27］。
NF-ΚB(nuclearfactor-ΚB)是一个多功能核转录因子，具有广泛的生物学活性，激活后可促进细胞因子、黏附分子、趋化因子等基因转录，在炎症反应中起重要作用。茄根酸性组分对脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞NF-ΚB的活化具有显著抑制作用［28］。
6对巨噬细胞抗肿瘤作用的影响
巨噬细胞构成机体抗肿瘤免疫的重要防线，激活的巨噬细胞通过多种机制发挥杀瘤作用。
实验表明：在荷瘤小鼠中红毛五加多糖能够加强巨噬细胞的吞噬作用和化学发光现象，并且增加了补体C3分裂产物和巨噬细胞的结合活性以及C3阳性细胞的比例，从而显著抑制了肉瘤180的生长和延长了小鼠的生存时间［29］。
7对巨噬细胞细胞凋亡的影响
尽管巨噬细胞的完全激活是其更好地行使功能所必需的，但是巨噬细胞的激活如果不受控制就可能造成对机体的损伤。因此，研究激活条件下巨噬细胞的死亡将有助于认识炎症反应的平衡机制。破骨细胞来源于关节滑膜组织中骨髓干细胞/巨噬细胞，其细胞凋亡作用在骨代谢调控和骨质疏松症等骨代谢疾病的发生、发展过程中具有重要意义。研究发现：淫羊藿提取物能够诱导破骨细胞凋亡并且剂量依赖性的抑制骨吸收［30］。
综上所述，天然植物产物对巨噬细胞的作用研究已经涉及到了巨噬细胞功能的各个方面，但其作用的具体分子机制尚待进一步深入的研究，这也将为新药开发提供更坚实的理
参考文献
［1］MiyakeM，SasakiK，IdeK，etal.HighlyoligomericprocyanidinsameliorateexperimentalautoimmuneencephalomyelitisviasuppressionofTh1immunity［J］.JImmunol，2006，176(10):5797.
［2］XuW，HouW，YaoG，etal.InhibitionofTh1-andenhancementofTh2-initiatingcytokinesandchemokinesintrichosanthin-treatedmacrophages［J］.BiochemBiophysResCommun，2001，284(1):168.
［3］LiuJ，WuQL，FengYH，etsuppressesCD80andCD86expressionsandIL-12productioninTHP-1cells［J］.ActaPharmacolSin，2005;26(2):223.
［4］VomelT.Effectofaplantimmunostimulantonphagocytosisoferythrocytesbythereticulohistiocytarysystemofisolatedperfusedratliver［J］.Arzneimittelforschung，1985，35(9):1437.
［5］Bin-HafeezB，HaqueR，ParvezS，etal.Immunomodulatoryeffectsoffenugreek(TrigonellafoenumgraecumL.)extractinmice［J］.IntImmunopharmacol，2003，3(2):257.
［6］王鹏云，王赛贞，林树钱，等。灵芝孢子和破壁孢子多糖对体外培养的小鼠脾淋巴细胞及腹腔巨噬细胞免疫调节活性的比较［J］.北京大学学报(医学版)，2005，37(6):569.
［7］王聚乐，孙洋，周惠英，等。藏药忍冬果对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及分泌细胞因子的影响［J］.中国中药杂志，2006，31(2):145.
［8］何为，杨业金，王辉丽，等。雷公藤内酯醇对小鼠腹腔巨噬细胞杀伤活性的影响［J］.现代免疫学，2004，24(2):116.
［9］NathanC，XieQW.Nitricoxidesynthases:roles，tollsandcontrols［J］.Cell，1994，78:915.
［10］RuZhou，Shen-XiZheng，WeiTang，etal.InhibitionofInducibleNitric-OxideSynthaseExpressionby(5R)-5-HydroxytriptolideinInterferon-γ-andBacterialLipopolysaccharide-StimulatedMacrophages［J］.JPharmacolExpTher，2006，316(1):121.
［11］陈伟，林新华，黄丽英，等。库拉索芦荟多糖对小鼠腹腔巨噬细胞一氧化氨生成的影响［J］.中国现代应用药学杂志，2006，23(1):17.
［12］delasHerasB，HoultJR.Non-cytotoxicinhibitionofmacrophageeicosanoidbiosynthesisandeffectsonleukocytefunctionsandreactiveoxygenspeciesoftwonovelanti-inflammatoryplantditerpenoids［J］.PlantaMed，1994，60(6):501.
［13］陈正山，王勤，王廷璞，等。秃疮花注射液对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响［J］.上海免疫学杂志，2001，2l(4):216.
［14］MellingerCG，CarboneroER，NoletoGR，etal.ChemicalandbiologicalpropertiesofanarabinogalactanfromPhyllanthusniruri［J］.JNatProd，2005，68(10):1479.
［15］WuMJ，HuangCL，LianTW，etal.AntioxidantactivityofGlossogynetenuifolia［J］.JAgricFoodChem，2005，53(16):6305.
［16］KrakauerT，LiBQ，YoungHA.etal.Theflavonoidbaicalininhibitssuperantigen-inducedinflammatorycytokinesandchemokines［J］.FEBsLett，2001，500(1-2):52.
［17］KrakauerT，ChenX，HowardOM，etal.Triptolideattenuatesendotoxin-andstaphylococcalexotoxin-inducedT-cellproliferationandproductionofcytokinesandchemokines［J］.ImmunopharmacolImmunotoxicol，2005，27(1):53.
［18］WangH，LiW，LiJ，etal.Theaqueousextractofapopularherbalnutrientsupplement，Angelicasinensis，protectsmiceagainstlethalendotoxemiaandsepsis［J］.JNutr，2006，136(2):360.
［19］JuDW，ZhengQY，CaoX，etal.EsculentosideAinhibitstumornecrosisfactor，interleukin-1，andinterleukin-6productioninducedbylipopolysaccharideinmice［J］.Pharmacology，1998，56(4):187.
［20］SoaresMB，BellintaniMC，RibeiroIM，etal.Inhibitionofmacrophageactivationandlipopolysaccaride-induceddeathbyseco-steroidspurifiedfromPhysalisangulataL［J］.EurJPharmacol，2003，459(1):107.
［21］RiningerJA，KicknerS，ChigurupatiP，etal.ImmunopharmacologicalactivityofEchinaceapreparationsfollowingsimulateddigestiononmurinemacrophagesandhumanperipheralbloodmononuclearcells［J］.JLeukocBiol，2000，68(4):503.
［22］GoelV，ChangC，SlamaJV，etal.AlkylamidesofEchinaceapurpureastimulatealveolarmacrophagefunctioninnormalrats［J］.IntImmunopharmacol，2002，2(2-3):381.
［23］Bottex-GauthierC，VidalD，PicotF，etal.Invitrobiologicalactivitiesofarglabin，asesquiterpenelactonefromtheChineseherbArtemisiamyrianthaWall.(Asteraceae)［J］.BiotechnolTher，1993，4(1-2):77.
［24］张骏，翁福海，李会强，等。大黄素对大鼠腹腔巨噬细胞产生的TNF-α，IL-1，IL-6及细胞［Ca2+］的影响［J］.中草药，2001，32(8):718.
［25］MeansTK，GolenbockDT，FentonMJ.ThebiologyofToll-likereceptors［J］.CytokineGrowthFactorRev，2000，1:219.
［26］ShaoBM，XuW，DaiH，etal.AstudyontheimmunereceptorsforpolysaccharidesfromtherootsofAstragalusmembranaceus，aChinesemedicinalherb［J］.BiochemBiophysResCommun，2004，320(4):1103.
［27］FuSL，HsuYH，LeePY，etal.DioscorinisolatedfromDioscoreaalataactivatesTLR4-signalingpathwaysandinducescytokineexpressioninmacrophages［J］.BiochemBiophysResCommun，2006，339(1):137.
［28］汪蓥植，沈映君，叶红，等。茄根酸性组分对脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞核因子ΚB表达的影响［J］.时珍国医国药，2005，16(11):1088.
【关键词】巨噬细胞；小鼠；吞噬功能；检测方法
细胞吞噬作用最早是单细胞动物摄取营养物质的方式，也是原始防御作用。通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察，可使学生加深理解细胞吞噬作用的过程及意义。本项目通过改用酵母菌作为吞噬颗粒，希望可以得到更全面、直观、生动的巨噬细胞吞噬观测效果。同时，改用体外吞噬法来检测巨噬细胞的吞噬功能，使实验更加简便、易行、经济。通过以上优化及改进，旨在探讨建立一种更为经济，简便直观的观察小鼠巨噬细胞吞噬效果的实验改良法。
一、材料
1．小白鼠腹腔注射液
6%淀粉肉汤。在100mL蒸馏水中加入牛肉膏0.3g，蛋白栋1g，氯化钠0.5g，加热后加入可溶性淀粉6g，促使溶解后煮沸灭菌，置4℃冰箱保存。用时水溶融化即可。
2．吞噬物
酵母菌菌液。将酵母菌接种于麦汁斜面培养基上，培养24小时后，用生理盐水反复吹打冲洗斜面培养基上的酵母菌，离心收集菌体，制成菌悬液后加热杀死菌体。用1％美蓝染色，反复生理盐水洗涤离心3次后，制成菌悬液，可长期4℃冰箱保存备用。
二、方法
在实验前一天，给小白鼠腹腔注射6%淀粉肉汤1mL/只，轻按小白鼠腹部，使悬液分散。24h后将注射过淀粉肉汤的小白鼠腹腔注射10亿/mL的酵母菌菌液1mL/只，颈椎脱臼法处死小鼠，用注射器从小鼠腹腔吸出腹腔液。在eppendorf管中各加入巨噬细胞悬液和酵母菌菌液各300µL，置37℃温箱保温20min。用滴管吸取混合液滴片，加盖玻片后直接用高倍镜观察，并随时滴片继续观察不同时期的吞噬状态。
三、效果
本实验与常规体内吞噬鸡红细胞法相比，具有以下特点：①改选酵母菌作为吞噬颗粒来观察巨噬细胞的吞噬效果。酵母菌体积极较小，与鸡红细胞相比更易被巨噬细胞吞噬，因此在有限的实验时间内更易观察到吞噬现象的三种阶段，吞噬现象观察更为生动全面。酵母菌还可预先被染色，与其它细胞区分明显，在显微镜下有更加直观、生动的观察，在室温适宜时，还可作吞噬过程的连续摄影，增加了实验的直观性。另外，酵母菌可长期保存，活化方法简易可行，较血细胞而言大大节省了实验费用；②改用直观简便的体外eppendorf管法来达到实验效果。在此法中，巨噬细胞和酵母菌各取适量于eppendorf管中，两者完全处于自由悬浮状态，有充分的接触机会，比在体内注入酵母菌更易全面接触，所以检测的吞噬指数更高，观察更为清晰直接。还可避免学生在注射鸡红细胞时常因注射部位的偏差，吸取腹腔液观察时常有鸡红细胞量过少的等问题出现，导致实验结果观察失败。③优化后实验可与动物免疫血清制备及其检测的实验相结合，使得老鼠实验成本大为降低，从而更加经济。总之，希望采用这种方法后，使巨噬细胞吞噬实验变得操作简单，易于掌握，费用降低，观察时清晰可辨，以达到较好的教学效果。
作者简介：
【中图分类号】R714【文献标识码】A【文章编号】1004-7484（2013）06-0072-02
子痫前期（preeclampsia，PE）子痫前期是妊娠期特有的疾病，以母体循环系统广泛的内皮功能紊乱导致血管收缩、肾小球损伤、血管通透性增高为主要病理生理基础，临床表现为高血压、蛋白尿、浮肿，严重时出现抽搐、昏迷，甚至母婴死亡。近年来很多学者认为，子痫前期的发病机制可能与遗传易感性，免疫适应不良，胎盘缺氧[1]和氧化应激有关。生殖免疫在发病机制中逐渐成为关注的热点。非特异性免疫是免疫功能的重要组成部分。单核-巨噬细胞在非特异性免疫中至关重要，当单核-巨噬细胞被活化后可以产生多种细胞因子和炎症介质。现将根据最新国内外研究对子痫前期的发生与单核-巨噬细胞和相关因子的关系做进一步阐述。
1单核-巨噬细胞的来源和功能
1.1单核-巨噬细胞包括骨髓中的前单核细胞、外周血中的单核细胞、以及组织内的巨噬细胞（Mφ）。巨噬细胞（Mφ）来源于血液中的单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。单核-巨噬细胞是自体重要的免疫细胞，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等重要作用。单核巨噬细胞是具有高度异质性的细胞群体，参与免疫，炎性反应及维持内环境的稳定。
1.2CD14，即LPS（Lipopolysacharide）受体，最初是一种存在于人
的单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的白细胞分化抗原，由TODD于1981年首次从人单核细胞表面发现[2]其生物学功能主要是识别、结合LPS或LPS/LBP复合物，介导LPS所致的细胞反应，在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。脂多糖抗原CD14几乎在所有的外周血单核细胞表面都有表达，依据其是否表达CD16可将其分为CD14+CD16-单核细胞CD14+CD16+单核细胞。正常状态时大部分单核细胞是CD14+CD16-，CD14+CD16+亚群占单核细胞的比例不到10%，但这一小部分的单核细胞亚群却在炎性反应中起重要作用[3]。
2单核-巨噬细胞在正常妊娠中的变化
妊娠期间，子宫内的巨噬细胞表达出抗原提呈和杀伤肿瘤细胞的活化标志，有较多的巨噬细胞表达组织相容性Ⅱ类抗原（Ia）。Sacks等认为非特异性免疫功能可能是妊娠期间特异性免疫功能降低的一种补偿，在调节母体与胎儿之间关系中发挥重要作用。
3巨噬细胞炎性因子与妊娠期高血压疾病
3.1TNF-α
肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）是一种多肽类物质，相对分子量为17000，主要由单核巨噬细胞产生，属于介导天然免疫的细胞因子，与生殖的关系密切。在妊娠、分娩及胎儿生长发育中均具有重要作用。正常妊娠时，TNF-α维持在较低水平，调节胎盘组织的正常生长和功能发挥，促进滋养层细胞的增殖和侵袭性生长，增加子宫胎盘血供，促进胎儿生长发育。TNF-α是一种主要由被激活的巨噬细胞产生的有多种活性的多肽类细胞因子，具有广泛的生物学效应，其水平的过度升高可造成细胞损伤，与子痫前期的病理过程相似，是子痫前期发生的重要细胞因子[4-6]。Beck-mann，Serin，黄伟梅等〔7-8〕认为TNF-α与妊娠期高血压疾病的发生关系最密切。
3.2TGF-β
转移生长因子-β（transfor-minggrowthfactor-β，TGF-β）家族至少包括3种形式，人体内以TGFβ1为主要形式。机体多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-β。转移生长因子-β通过与细胞膜上的受体结合，调节细胞增殖、分化、以及导致细胞凋亡等内在的各种信号的传递。TGFβ可以影响滋养层细胞浸入能力以及胎盘发育。从而在妊娠期高血压疾病、胎儿宫内生长受限的发生可能有关。
3.3巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）
巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）属于一种淋巴造血因子，巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）主要是由T淋巴细胞在抗原或有丝分裂原的刺激下产生的；单核细胞、内皮细胞成纤维细胞等也可产生。其受体表达于循环的单核细胞和组织巨噬细胞以及胎盘的滋养层细胞。妊娠的胎盘滋养细胞及子宫蜕膜细胞可产生M-CSF，M-CSF刺激其靶细胞释放前列腺素E、IL-1、IL-6、IFN-C、肿瘤坏死因子（TNF）-A等细胞因子。
综上所述，在子痫前期的发生发展过程中，巨噬细胞发挥着重要的作用，但因其分泌及表达的细胞因子种类繁多，很多潜在机制尚不清楚。因此，需要从分子水平以及信号传导途径来真正揭开巨噬细胞在子痫前期发生发展过程中的调控机制，从而为妊娠并发症的治疗开辟一条崭新而有效的途径。
参考文献：
[1]BelindaJim，ShuchitaS，TewabeK，etal.Hypertensioninpregnancy[J].CardiologyinReview，2010，18（4）：178-189.
[2]赵虎，周庭银，孔宪涛。综述与讲座。免疫学杂志.2000年16（1）
[3]MatsubaraT，IchiyamaT，FurukawaSImmunologicalprofileofperipheralbloodlymphocytesandmonocytes/macrophagesinKawasakidisease[J]ClinExpImmunol，2005，141（3）：381
[4]赵茵，夏曙，邹丽・妊娠期高血压疾病患者血清TNF-α水平及胎盘TNF-αmRNA表达变化的意义[J]・中国优生与遗传杂志，2007，15（6）：11-13・
[5]GULATIR・RaisedserumTNF-alpha，bloodsugarandu-ricacidinpreeclampsiaintrimesterofpregnancy[J]・JNMAJNepalMedAssoc，2005，44（158）：36-38・
[6]陈文思，卢建溪，宋志兴・肺癌患者治疗前后血清白介素-6、白介素-8、肿瘤坏死因子-α水平的变化及意义[J]・新医学，2007，38（11）：740-741・
【关键词】辛伐他汀；巨噬细胞；基质金属蛋白酶-9;金属蛋白酶组织抑制因子-1
Abstract:【Objective】Toinvestigatetheeffectsofsimvastatindrug-serumontheexpressionandsecretionofmatrixmetalloproteinase-9andtissueinhibitorofmetalloproteinase-1inU937monocyte-derivedmacrophages.【Methods】FifteenNewZealandrabbitswererandomizedto3groups,normalcontrolgroup(NL,n=5),atheroscleroticmodelgroup(AS,n=5)andsimvastatindrug-serumgroup(SIM,n=5).Therabbitatheroscleroticmodelwasdevelopedbyhighcholesterolfeeding.Thentheyweremedicatedwithsimvastatinliquorbygavagetopreparesimvastatindrug-serum.U937monocyte-derivedmacrophageswereincubatedwithdifferentconcentrations(5%,10%,and20%)ofsimvastatindrug-serumfor24hours.ThemRNAexpressionandproteinsecretionofMMP-9andTIMP-1weredetectedbyRT-PCRandELISA.【Results】ComparedtosameconcentrationASgroup,5%,10%,and20%SIMgroupsignificantlyinhibitedtheexpressionofMMP-9mRNAinU937monocyte-derivedmacrophages(P=0.005,0.041,and0.013),andtheexpressiondifferenceofTIMP-1mRNAwerenotsignificant(allP>0.05).ComparedtosameconcentrationASgroup,10%and20%SIMgroupnotonlysignificantlyinhibitedthesecretionofMMP-9inU937monocyte-derivedmacrophages(P=0.009and0.001),butalsosignificantlyincreasedthesecretionofTIMP-1(P=0.017and0.001).【Conclusion】SimvastatininhibitstheexpressionandsecretionofMMP-9andenhancesthesecretionofTIMP-1.
Keywords:simvastatin;macrophage;matrixmetalloproteinase-9;tissueinhibitorofmetalloproteinase-1
冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定，继而破裂导致血栓形成是急性冠脉综合征最主要的发病机制[1,2]。斑块脂质核心大、纤维帽薄、巨噬细胞多是结构性易损斑块[3]。斑块内单核巨噬细胞聚集，基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMP)增多，金属蛋白酶组织抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinases,TIMP)减少，导致斑块内胶原降解，纤维帽变薄，是斑块稳定性下降的重要原因[4,5]。临床研究显示他汀对急性冠脉综合征治疗有效，可能与改善内皮功能、抗炎及稳定斑块等调脂以外的作用有关[6],但其具体机制尚未完全明确。本研究拟观察辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响，以探讨辛伐他汀稳定斑块、治疗急性冠脉综合征的机制。
1材料与方法
1.1材料准备
雄性纯种新西兰大白兔，体质量2.0~2.5kg,购自中山大学动物实验中心。人单核白血病细胞株U937细胞，购自中山大学动物实验中心细胞库。辛伐他汀药片，购自默沙东公司，实验时溶解于蒸馏水灌胃。
RPMI1640培养基，购自Gibco公司。新生牛血清，购自PAA公司。佛波酯(PMA),购自Sigma公司。Trizolreagent,购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒，购自Fermentas公司。Taq酶购自Takara公司。PCR反应引物，由上海生工生物技术有限公司合成。人MMP-9、TIMP-1细胞上清ELISA试剂盒，购自RapidBio公司。
1.2动脉粥样硬化模型建立及含药血清制备
15只新西兰大白兔随机分为3组：正常对照组(normal,NL)、粥样硬化模型组(atherosclerosisgroup,AS)和辛伐他汀含药血清组(simvastatingroup,SIM),每组5只。正常对照组予普通饲料喂养12周，其余各组予高脂饲料(1%胆固醇、10%猪油、89%普通饲料)喂养10周后，每组随机处死1只，证实有大动脉粥样硬化形成后，继续高脂喂养至12周，其中SIM组于第11周起给予辛伐他汀5mg/kg,每天1次，灌胃14d。末次给药前禁食12h,给药后1h颈动脉无菌取血，分离血清，同组动物血清混匀，0.22?滋m滤膜过滤灭菌，-80℃保存备用。
1.3细胞培养及干
预
U937细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中，置于含5%CO2,37℃培养箱中，待细胞生长至接近融合时传代，2~3代后用于实验。调整细胞密度为5×106/mL,接种于6孔培养板，加入PMA使终浓度为50ng/mL,培养48h后见悬浮生长的U937细胞分化为巨噬细胞，伸出伪足，贴壁生长。弃去旧培养基，PBS液洗涤后，予不含血清的RPMI1640培养基继续培养24h,弃去培养基。分别加入各含5%、10%、20%正常兔血清，5%、10%、20%粥样硬化兔血清，以及5%、10%、20%辛伐他汀含药血清的RPMI1640培养基，每组设3个平行组，培养24h用于RT-PCR实验。
1.4总RNA提取
吸净培养基，每孔加入1mL的Trizol液，吹打裂解细胞，收集于无RNA酶离心管中，室温静置5min。加入0.2mL氯仿，剧烈颠倒15s,室温静置3min,4℃,12000×g离心10min。转移上层水相液500?滋L到新的离心管，加入500?滋L异丙醇，室温静置10min,4℃,12000×g离心7min。弃上清，加入1mL无RNA酶水配制的75%酒精，振荡混匀，4℃,7500×g离心5min。重复酒精洗涤沉淀一遍，弃去酒精，室温干燥5min,融解RNA于30?滋L无RNA酶水中，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计测定RNA含量，计算出RT-PCR所需样品量。
1.5RT-PCR
取总RNA1.5?滋g,按逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA。以β-actin为内参照，进行半定量逆转录聚合酶链式反应。聚合酶链式反应：95℃5min预变性，94℃45s变性，56℃30s退火，72℃45s延伸，共35个循环，最后一次循环在72℃延伸7min。RT-PCR产物用含1.5%琼脂糖凝胶电泳，Labwork成像系统采集图像及分析。合成引物序列，MMP-9-上游引物：5′-AGGACGGCAATGCTGAT-3′,下游引物：5′-CGCCACGAGGAACAAACT-3′,扩增产物为362bp;TIMP-1-上游引物：5′-TTCCGACCTCGTCATCAG-3′,下游引物：5′-GCATTCCTCACAGCCAAC-3′,扩增产物为340bp;β-actin-上游引物：5′-ATCGTGCGTGACATTAAGG-3′,下游引物：5′-ACAGGACTCCATGCCCAGG-3′,扩增产物为195bp。
1.6ELISA测定
收集细胞上清液，4℃,3000r/min离心10min,取上清，-80℃保存待检。ELISA采用双抗体夹心法，按照说明书步骤进行，测定细胞上清MMP-9、TIMP-1浓度。
1.7统计学处理
所有数据均以均数±标准差(x±s)表示，三组间比较用单因素方差分析，两组间比较用LSD-t检验，应用SPSS10.0统计分析软件进行统计分析，P<0.05为差异有显着性。
2结果
2.1辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9mRNA表达的影响
与相同浓度NL组相比，5%、10%、20%AS组MMP-9mRNA表达均显着性增高(P值均<0.05)。与相同浓度AS组相比，5%、10%、20%SIM组MMP-9mRNA表达均显着性降低(P值分别为0.005、0.041和0.013)。与相同浓度NL组相比，5%、10%SIM组MMP-9mRNA表达均增高(P值分别为0.034和0.029,表1、图1)。
不同浓度间SIM组MMP-9mRNA表达差别无统计学意义(F=1.747,P=0.252)。
2.2辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1mRNA表达的影响
NL组、AS组和SIM组不同浓度之间TIMP-1mRNA表达无显着差异(表2、图2)。5%、10%和20%SIM组之间TIMP-1mRNA的表达有显着性差异(F=6.498,P=0.032)。与5%SIM组相比，10%、20%SIM组TIMP-1mRNA的表达显着性增加(P=0.039、0.014),而10%与20%SIM组之间无显着性差异(P=0.446)。
2.3辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9蛋白分泌的影响
与同浓度NL组比较，10%、20%AS组MMP-9分泌均显着性增加(P=0.007、0.002);5%、10%、20%SIM组MMP-9分泌无显着性差异(P=0.824、0.857、0.658)。与同浓度AS组比较，5%SIM组MMP-9分泌无显着性差异(P=0.427),10%、20%SIM组MMP-9分泌显着性减少(P=0.009、0.001,表3)。
SIM组不同浓度之间MMP-9分泌无显着性差异(F=0.985,P=0.427)。
2.4辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1蛋白分泌的影响
与同浓度NL组比较，AS组TIMP-1分泌均显着性减少(P=0.004、0.044、0.003);与同浓度NL组比较，5%SIM组TIMP-1分泌减少(P=0.038)。与同浓度AS组比较，10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显着性增加(P=0.017、0.001,表4)。
SIM组不同浓度之间TIMP-1分泌有显着性差异(F=6.555,P=0.031)。与5%SIM组相比，10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显着性增加(P=0.038和0.014)。而10%和20%含药血清之间差异无显着性(P=0.456)。
3讨论
3.1MMP/TIMP与动脉粥样斑块稳定性
急性冠状动脉综合征患者是易损病人[1],通常指在冠状动脉粥样硬化的基础上，斑块破裂，继而血小板粘附聚集和血栓形成，引起完全或不完全的血管阻塞，导致不稳定型心绞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死及猝死。有报道[7-9]冠脉“罪犯”病变处多是软斑块、以正性重构为主，常伴血栓形成。斑块内细胞外基质过度降解，导致斑块中胶原含量减少，纤维帽变薄，是影响斑块稳定的重要因素。斑块破裂常发生在富含单核巨噬细胞的斑块肩部，此处巨噬细胞可分泌大量MMP,促进纤维帽降解[10]。MMP-9,又称明胶酶B,是巨噬细胞分泌的主要基质金属蛋白酶。TIMP是MMP的抑制物，目前已发现有4种：TIMP-1~TIMP-4,它们均可与激活的MMP呈1∶1结合，从而使MMP失活。用免疫组化方法检测动脉粥样硬化斑块显示TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3显着性增多，且多存在于斑块肩部的巨噬细胞、纤维帽和脂核内，与MMP分布部位一致，部分抑制MMP的活性[11]。急性冠脉综合征患者存在着由炎症反应导致的以MMP-9升高为主的MMP-9/TIMP-1失衡状态[2]。因此MMP与TIMP之间的平衡，对斑块稳定性的调节具有重要意义。研究还表明[12],MMP-9在转录水平上受多种细胞因子、生长因子及活性物质的调节，而TIMP的表达很少受细胞因子和生长因子的影响。本实验采用血清药理学方法观察到，与同浓度NL组相比较，5%、10%和20%AS组U937单核源巨噬细胞MMP-9表达均显着性增高(P值均<0.05)。这可能是因为粥样硬化血清中含有较高的低密度脂蛋白胆固醇，以及大量激活的炎性细胞因子、生长因子以及其他活性物质，促进MMP-9的表达。与相同浓度NL组比较，AS组TIMP-1mRNA表达无显着性差异，但TIMP-1的分泌均显着性减少(P<0.05),提示动脉粥样硬化血清不但可使巨噬细胞MMP-9增加，同时还可使TIMP-1分泌增加(翻译后水平)而表达(mRNA水平)并未增加，具体机制尚不清楚。
3.2他汀药与MMP/TIMP
PROVEIT(TIMI-22)研究[13]显示强化他汀治疗可使ACS患者30d的临件减少，在稳定的患者，使临件长期降低，但其具体机制尚未完全明确。Luan等[14]报道，西立伐他汀呈剂量依赖性抑制兔平滑肌细胞和巨噬细胞MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9,但对TIMP-1和TIMP-2无影响。本研究显示，与相同浓度AS组相比，5%、10%和20%SIM组MMP-9mRNA表达均显着性降低(P值<0.05);10%、20%SIM组MMP-9蛋白的分泌显着性减少(P值均<0.01)。与相同浓度AS组相比，SIM组TIMP-1mRNA表达无显着性差异(P>0.05);但10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显着性增加(P值均<0.01)。与Luan等[14]的报道有所不同，本研究显示辛伐他汀不但在一定剂量范围内可抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌，而且增加TIMP-1的分泌。这可能是辛伐他汀稳定斑块、减少临件的机制之一。他汀具有多效作用(Pleiotropiceffects)[15],除了调脂作用外，还有抗炎、改善内皮功能等作用。辛伐他汀可能通过抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌，同时还增加TIMP-1的分泌，从而调节MMP与TIMP之间的平衡，起到稳定斑块的作用。
【参考文献】
FALKE,SHAHPK,FUSTERV.Coronaryplaquedisruption[J].Circulation,1995,92(3):657-671.
刘金来，关良劲，谢旭晶，等。急性冠状动脉综合征患者血浆基质金属蛋白酶及其抑制因子的变化[J].中国病理生理杂志，2004,20(10):1921-1922.
NAGHAVIM,LIBBYP,FALKE,etal.Fromvulnerableplaquetovulnerablepatient:acallfornewdefinitionsandriskassessmentstrategies:PartI[J].Circulation,2003,108(14):1664-1672.
CRISBYM,NORDIN-FRIDRIKSSONG,SHSHPK,etal.Pravastatintreatmentincreasescollagencontentanddecreaseslipidcontent,inflammation,metallproteinases,andcelldeathinhumancarotidplaques:implicationsforplaquestabilization[J].Circulation,2001,103(7):926-933.
刘金来，关良劲，朱承明，等。急性冠状动脉综合征患者颈动脉斑块与血浆基质金属蛋白酶的相关性[J].中国动脉硬化杂志，2005,13(6):763-766.
林玲，欧少雯，吕红，等。阿托伐他汀对老年冠心病患者血小板？琢颗粒膜蛋白的MP-140的影响[J].热带医学杂志，2007,7(1):55-56.
KOTANIJ,MINTZGS,CASTAGNAMT,etal.Intravascularultrasoundanalysisofinfarct-relatedandnon-infarct-relatedarteriesinpatientswhopresentedwithanacutemyocardialinfarction[J].Circulation,2003,23(107):2889-2893.
VARNAVAAM,MILLSPG,DAVIESMJ,etal.Relationshipbetweencoronaryarteryremodelingandplaquevulnerability[J].Circulation,2002,105(8):939-943.
王庆，凌文华。C反应蛋白与动脉粥样硬化不稳定斑块[J].中山大学学报：医学科学版，2004,25(3S):384-386.
LENDONCL,DAVIESM,BORNG,etal.Atheroscleroticplaquecapsarelocallyweakenedwhenmacrophagedensityisincreased[J].Atherosclerosis,1991,87(1):87-90.
FABUNMIRP,SUKHOVAGK,SUGIYAMAS,etal.Expressionoftissueinhibitorofmetalloproteinases-3inhumanatheromaandregulationinlesion-associatedcells:apotentialprotectivemechanisminplaquestability[J].CircRes,1998,83(3):270-278.
VANDENSTEENPE,DUBOISB,NELISSENI,etal.BiochemistryandmolecularbiologyofgelatinaseBormatrixmetalloproteinase-9(MMP-9)[J].CritRevBiochemMolBiol,2002,37(6):375-536.
RAYKK,CANNONCP,MCCABECH,etal,PROVEIT-TIMI22Investigators.Earlyandlatebenefitsofhigh-doseatorvastatininpatientswithacutecoronarysyndromes:resultsfromthePROVEIT-TIMI22trial[J].JAmCollCardiol,2005,46(8):1405-1410.