[关键词]IL-6；基因多态性；冠心病；发病风险
[中图分类号]R285.5[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2013）06（a）-0028-03
冠状动脉粥样硬化是心脏病是冠状动脉粥样硬化导致血管腔栓塞，最后致心脏缺氧而引起的疾病，统称冠心病。动脉粥样硬化性疾病是发展中国家和发达国家主要死亡原因，我国冠心病发病和死亡率也呈现逐年上升的趋势[1]。而冠心病发病是多种因素造成的，包括了基因的和环境的因素，例如炎症、吸烟、高血压、糖尿病和基因易感性[2-3]。其中，炎性反应与细胞因子在动脉粥样硬化的发生和发展过程中起到了重要的作用，炎性反应及某些炎症因子的活性也是该疾病发生的重要因素。而白介素系统、肿瘤坏死因子、C-反应蛋白等都是重要的炎症因子。而之前有研究表明IL-6与冠心病发病有相关关系，是导致高血压和冠心病的危险因素[3]。而其基因启动子区域的白细胞介素-6174G/C（IL-6174G/C）rs1800795和白细胞介素-6572G/C（IL-6572G/C）rs1800796位点存在多态性。因此，为了进一步探讨白细胞介素IL-6174G/C和IL-6572G/C与冠状动脉粥样硬化的相关性，本研究采用病例对照方法采用PCR分析IL-6174G/C和IL-6572G/C与冠心病的相关性。
1对象与方法
1.1研究对象
病例来源于2008年7月～2011年7月内蒙古医科大学附属医院心内科患者，共计103人。病例纳入标准为根据冠状动脉造影结果，以主要管腔狭窄的直径≥70%或左冠状动脉主干管腔狭窄直径≥50%为诊断标准。对照组共选取了214例同期住院患者，未发现任何斑块或狭窄的病例。所有纳入对象如有感染、肿瘤、肝肾疾病、心肌炎、糖尿病、自身免疫性疾病、心肌炎、严重创伤等疾病均排除。总共选取103名冠心病患者，其中男62例，女41例，年龄为50～79岁，平均（61.5±11.4）岁。本资料通过内蒙古医科大学附属医院伦理委员会通过，所有研究对象均知情同意，并签署知情同意书。
1.2DNA提取
所有研究对象采取空腹静脉血5mL，在2h内，采用3000r/min离心10min，提取血清冷冻于-20℃备用。采用TIANampbloodDNAkit（TiangenBiotech，Beijing，China）试剂盒提取DNA。IL-6174G/C位点PCR扩增上游引物5′-GGAGTCACACACTCCACCT-3′、下游引物5′-CTGATTGGAAACCTTATTAAG-3′。IL-6572G/C位点PCR扩增上游引物5′-GAGACGCCTTGAAGTAACTG-3′、下游引物5′–GAGTTTCCTCTGACTCCATCGCA-3′。反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸1min，重复35个循环；反应体系：DNA2μL、2×Taqmastermix10μL、sybgreen0.8μL、引物0.8μL、去离子水6.4μL。取2μL扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，检验所得产物的特异性。
取PCR扩增产物10μL，以8u限制性内切酶Mbi处理IL-6174G/C位点的扩增产物，以6u限制性内切酶Bsrb处理IL-6-634扩增产物，37℃孵育2h后将酶切产物在3%的琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶电泳分析系统中观察，确定IL-6174G/C和IL-6572G/C位点的基因型。
1.3统计学方法
所有的分析均采用SPSS11.0软件进行分析，所有计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用百分比表示，比较采用卡方检验。Hardy-Weinberg平衡采用χ2检验。OR和95%CI用作评估IL-6174G/C和IL-6572G/C基因多态性对冠心病风险影响的情况。另外，采用多变量Logistic回归分析模型在调整性别、吸烟、体重指数（BMI）、高血压、糖尿病、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）分析IL-6174G/C和IL-6572G/C基因多态性对冠心病的影响。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1患者基本情况
实验组平均年龄为（60.3±7.5）岁，对照组平均年龄为（62.5±7.7）岁。与对照组相比，男性、吸烟、高BMI，糖尿病和高血压是冠心病的危险因素（P<0.05）。另外，低TC浓度，HDL-C浓度、低LDL-C浓度和高TG浓度是冠心病的危险因素（P<0.05）。两组研究对象基本情况见表1。
2.2IL-6174G/C和IL-6572G/C基因频率分布
结果显示，IL-6572C/C基因型在病例组（11.7%）中的百分比显著性高于对照组（2.8%），差异有统计学意义（P<0.05）。IL-6174G/C和IL-6572G/C基因频率分布见表2。
2.3IL-6174G/C和IL-6572G/C基因多态性与冠心病的相关关系
由表3可知，IL-6174G/C基因多态性与冠心病无相关关系，IL-6174T/C和IL-6174C/C与野生型基因相比并没有显著性的增加冠心病的风险（P>0.05）。而IL-6572C/C基因型与G/G基因型相比，C/C基因型能显著性的增加冠心病的风险，OR（95%CI）值为4.91（1.61～16.52），调整性别，BMI，吸烟，糖尿病，高血压，TC，HDL-C，LDL-C和TG后，OR（95%CI）值为5.10（1.66～17.40）。
3讨论
冠心病的主要病理基础是冠状动脉的粥样硬化，而冠状动脉的粥样硬化是一种多因素引起的的疾病，包括了脂质代谢紊乱、感染、高血压、肥胖、糖尿病等多种因素都可能引起的疾病，之前有研究表明[2]动脉粥样硬化是一种慢性炎性反应的过程，是以动脉壁脂质沉积炎症细胞聚集为特征。主要机制是最开始的炎性反应对血管损伤做出了保护性的回应，如果损伤持续性的出现，保护性回应逐渐转变为炎症，最后导致粥样斑块的产生。
IL-6是多种生物学活性的细胞因子，能够调节血脂代谢，参与炎性反应过程、介导白细胞的黏附与聚集等作用，IL-6可以通过参与复杂的细胞因子促进动脉粥样硬化的发生或发展[4-6]。IL-6细胞因子可以刺激血管活性物质的释放，诱导纤维蛋白原的分泌和C反应蛋白的生成。之前有实验研究表明，动脉粥样硬化斑块区尤其是富含有巨噬细胞区域有大量的IL-6的表达，而动脉粥样硬化管壁IL-6含量水平比正常血清中的水平高了接近200倍[7-8]。而之前有研究表明，血清中的IL-6水平可以预测冠心病的风险，冠心病的的严重程度及预后与血清中的IL-6水平有相关关系[9-10]。在芬兰的纳入的87病例的研究表明，血管内壁的厚度与IL-6174G/C显著性相关关系，对于个体携带有174C/C基因型的内膜厚度交GG基因型厚度高11%[11]。另一个在欧洲的研究表明IL-6174G/C基因多态性与冠心病发病风险显著性的相关性，对于个体携带174C/C和C/G基因型患冠心病发病风险分别是携带GG型基因的1.35倍和1.31倍[12]。另一个在英国6年随访的研究表明，162名冠心病患者中，携带IL-6174G/C和C/C基因型的个体携带冠心病的风险比IL-6174G/G基因型的风险显著性增高，OR值为1.54。而该研究的生存分析结果表明IL-6174G/C基因型与G/G基因型相比，G/C基因型的生存率显著性的低于G/G基因型，说明C等位基因能显著性的增加冠心病发病风险[13-16]。而本研究结果表明，IL-6174C/C基因型的冠心病发病风险显著性的高于G/G基因型，调整性别，BMI，吸烟，糖尿病，高血压，TC，HDL-C，LDL-C和TG后的OR（95%CI）为5.10（1.66～17.40）。本研究的研究结果与之前研究结果相似。
因此，IL-6174G/C基因多态性与冠心病发病风险有显著性的相关关系，携带IL-6174C/C基因型的个体患冠心病的风险是携带G/G基因型的5倍多。IL-6174G/C基因多肽是冠心病独立的危险因素。
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关键词：二甲双胍糖尿病基因多态性
二甲双胍是目前治疗2型糖尿病最常见的药物[1]，具有较好的降糖效果，其具体作用是抑制肝脏和肾脏糖异生，抑制肝糖原输出，同时能够提高肝脏对于胰岛素的敏感性。研究指出，有多种蛋白参与了二甲双胍在机体中的代谢，包括二甲双胍的吸收、转运以及排泄过程，并且相关蛋白的基因多态性是当前的研究热点。本文通过对二甲双胍治疗糖尿病基因多态性的相关文献进行检索，就近年来研究较多的，与二甲双胍治疗糖尿病相关的多药物和毒素排出转运蛋白(MATEs)、有机阳离子转运蛋白(OCTs)及共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)的多态性相关研究进展进行综述。
MATE1基因多态性与二甲双胍疗效的关系MATE1信使RNA被检测到表达于肝、肾组织中，其编码基因中含有多个变异位点，主要包括V10L、A310V、N474S、G64D、D328A等。其中除V10L外，其余几个变异位点如果发生基因突变，则会对MATE1的转运活性造成明显影响，尤其是G64D围边基因发生变异会对MATE1的转运活性造成直接影响，致使MATE1的转运活性降低或者消失，使得转运至胆管内的二甲双胍和尿液中的二甲双胍减少，而体内的二甲双胍浓度上升[2]。有学者进行了二甲双胍与MATE1基因多态性的相关研究。Tsuda等人[3]分别对基因敲除和基因未敲除的小鼠静脉注射二甲双胍，其中在基因敲除的小鼠尿液中二甲双胍排出量显著减少，并且二甲双胍在肝脏的浓度增加。MATE1是由SLC47A1基因编码的，关于二甲双胍的疗效受到SLC47A1基因多态性影响的相关研究层出不穷，其中rs2289669位点多态性是当前研究最多的。研究者通过对众多基因多态性的观察，发现了影响二甲双胍疗效的最大位点rs2289669G>A。有学者通过进行对所有的多态性与二甲双胍效果的相关研究发现[4],rs2289669G>A与患者糖化血红蛋白的降低存在密切相关性。有学者做了进一步研究发现[5],SLC47A1AA基因型患者在服用二甲双胍半年后，糖化血红蛋白水平明显下降，其机制可能与药动学的改变相关。
MATE2-K基因多态性与二甲双胍疗效的关系MATE2蛋白属于MATES家族的成员，MATE2K是MATE2的剪接变体，存在于肾小管刷状缘膜，将二甲双胍排泄到尿液中的主要转运体。
OCT1基因多态性与二甲双胍疗效的关系OCT1是表达于肝脏中的转运体蛋白，其作用是对肝脏摄取二甲双胍起到作用。随着研究的深入，发现OCT1具有基因多态性，并且与二甲双胍的疗效存在相关性。众所周知，二甲双胍进入肝脏主要依赖于OCT1，而且研究发现，OCT1rs622342A>C与MATE1rs2289669G>A这两种SNP(单核苷酸多态性)对于二甲双胍的效果具有相互作用，当这两种SNP均表达为突变纯合子基因型时，机体中糖化血红蛋白显著下降。然而，对于不同区域、国家的人，基因多态性的影响存在差异，即同一转运蛋白的不同变异位点的多态性对降糖效果存在影响，有学者纳入上海某医院的汉族糖尿病者作为研究对象，探究OCT1的SNPrs1867351、rs628031、rs4709400与rs2297374对二甲双胍效果的影响[6]。结果显示，以上这几种SNP对患者的空腹血糖、糖化血红蛋白以及餐后血糖的影响均不同，而且与北京地区糖尿病患者相比较，这几种SNP对二甲双胍效果的影响也不同，说明了基因多态性存在地域性差异。总体而言，OCT1基因多态性与二甲双胍的疗效存在相关性，但是对于不同基因型患者以及不同地域人群均有不同。
OCT2基因多态性与二甲双胍疗效的关系二甲双胍也是OCT2的作用底物，分布于肾脏。主要位于肾小管细胞基底膜的外侧，对二甲双胍由血液到肾小管细胞的转运途径进行控制，主要对二甲双胍的分泌与重吸收造成影响，这也是二甲双胍降低血糖的重要途径之一。研究指出，OCT2的基因多态性主要对二甲双胍在体内的清除率产生影响。有学者对OCT2基因多态性与二甲双胍在体内药动学的相关影响进行了研究[7]，该学者将携带OCT2突变基因、OCT2对照基因以及空载体转染至HEK-293细胞中，观察各个组别细胞对二甲双胍的摄取状态。结果发现转染OCT2突变基因的组别摄取二甲双胍效果最好。本研究又进行了进一步研究，纳入了23例健康志愿者，包括OCT2-808GG基因型14例，OCT2-808GT基因型9例。比较不同基因型志愿者二甲双胍的肾清除率与净分泌率，结果发现，808GT的肾清除率与净分泌率显著高于808GG基因型，这说明OCT2基因多态性对健康人群二甲双胍的药动学可能存在影响；但是本研究并未对不同基因型的糖尿病患者进行研究。有学者纳入了220例糖尿病患者[8]，包括OCT2808-GT基因型与OCT2808-GG基因型，研究糖尿病患者OCT2基因多态性与二甲双胍药动学及降糖作用，220例患者在口服二甲双胍1年后，发现GT基因型患者的糖化血红蛋白与肾清除率明显高于GG基因型患者，这说明808位点杂合突变会促使体内二甲双胍排泄，使机体中二甲双胍浓度降低，进而使其降糖效果减弱。以上研究不但证实了OCT2基因多态性与二甲双胍在健康机体中的关系，也证实了其与二甲双胍在糖尿病患者中的关系。
OCT3基因多态性与二甲双胍疗效的关系OCT3在全身器官组织中均可被检测到，且该基因参与了二甲双胍在机体的转运过程。但是有关OCT3基因多态性与二甲双胍药效的研究，目前还较少。Chen等人通过研究指出[9],OCT31199C>T与1267G>T的基因多态性能够使机体摄取二甲双胍的能力显著降低。此外，该学者还发现，OCT3131C>T的基因多态性能够使机体摄取二甲双胍的能力显著升高。说明不同的OCT3基因多态性与二甲双胍疗效不同，具体情况还有待进一步研究。
ATM基因多态性对二甲双胍疗效的影响ATM是一类调控DNA修复的基因，研究发现ATM基因被活化或者抑制后能够使二甲双胍的作用位点(AMPK)的活性发生改变[10]。相关研究发现，ATM基因多态性也与二甲双胍的治疗效果存在相关性。有学者在给予大鼠注射ATM抑制剂后[11]，检测其AMPK的状态，结果发现，不但AMPK激活作用被减弱，并且二甲双胍的作用靶点也明显减少，同时二甲双胍的疗效也被降低。一项关于英国糖尿病人群的基因分析显示，ATM基因的SNPrs11212617的基因多态性和二甲双胍的治疗效果密切相关，但是该研究结果并未被其他研究证实。
总结和展望一直以来，临床上对于糖尿病的治疗一直采用传统模式，但是对于不同个体，在治疗剂量无较大差别的情况下，治疗效果有显著差别。近年来，二甲双胍对于患者治疗应答不理想以及不良反应逐渐被重视，此外，二甲双胍相关基因多态性也是近年来临床学者关注的热点之一。其中，单个基因的多态性是当前研究较为广泛的。在糖尿病治疗过程中，通过对基因多态性的进一步研究，可以确定适合的治疗药物、药物的敏感性以及适合的治疗剂量，这可能会成为糖尿病治疗的新理念。
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[中图分类号]R979.1[文献标识码]A[文章编号]1671-7562（2007）02-0138-04
基因表达谱的显著差异是指导肿瘤个体化治疗的基础，已有多种抗肿瘤药物通过检测相关分子及其基因多态性来预测患者对相应药物的敏感性和毒性。氟脲嘧啶(5-FU)是最常用的化疗药物，与其它药物组成了多种有效的化疗方案。胸苷酸合成酶（TS)、二氢吡啶酶（DPD）、乳清酸磷酸核糖基转移酶（OPRT）等分别作为5-FU合成代谢和分解代谢的关键酶，在5-FU的作用途径中起着重要的作用，其基因的多态性与5-FU的疗效和毒性密切相关。
1TS
TS是由两个相同亚基组成的二聚体,作用于细胞周期G1至S期,是嘧啶核苷酸合成的限速酶,也是5-FU发挥细胞毒作用的目标酶。肿瘤细胞对5-FU敏感性与TS基因（TSmRNA）相关，Fukushima等[1]用5-FU处理人结肠癌KM12C细胞后得到对5-FU不敏感细胞（5-FU的抑制率为7.9%），其TS活性比未处理细胞（5-FU的抑制率为81.8%）高2~3倍，TSmRNA水平的增加与TS活性的增加是一致的。Amatori等[2]用5-FU处理Colo320、HT-29、CaCo-2和SW620这4种肿瘤细胞，并通过检测肿瘤细胞对5-FU的敏感程度，观察其与TSmRNA的关系。结果显示，在对5-FU最为敏感的CaCo-2中TSmRNA表达水平较低，而在对5-FU敏感性较低的SW620中TSmRNA高表达。
Lenz等[3]早年通过荧光定量PCR检测65例接受5-FU和铂类药物化疗胃癌患者的胃镜活检肿瘤组织TSmRNA水平，发现TSmRNA水平高者中位生存期为6个月，而TSmRNA水平低者为43个月。Edler等[4]用免疫组化法检测862例大肠癌患者（单独手术治疗/手术加5-FU辅助化疗）肿瘤组织中的TS蛋白水平，发现在单独手术组中低TS水平者生存期更长(P=0.04)。Ciaparrone等[5]通过免疫组化方法检测62例接受过含5-FU术后辅助化疗的结直肠癌患者肿瘤组织中的TS蛋白水平，结果发现，TS蛋白水平是转移性结直肠癌患者无病生存时间（DFS）及总生存时间（OS）的独立预后因素。TS蛋白表达水平低者，其DFS及OS优于TS蛋白表达高者。一项包含13项研究共887例进展期结直肠癌的Meta分析显示，高TS蛋白表达者预后不佳[6]。
在TS基因启动子区（TSER)，即5′端末翻译区(5′-UTR)存在28bp的重复片段多态性,与TS基因表达水平、5-FU化疗敏感性及毒性反应、远期生存率存在相关性。TSER的2和3倍重复片断最常见，Marcuello等[7]通过对89例转移性结直肠癌患者的研究，把TS基因型分为高表达组（2R/3G、3C/3G、3G/3G）和低表达组（2R/2R、2R/3C、3C/3C），结果发现，接受基于5-FU化疗后TS基因型低表达组的中位生存时间为50个月，高表达组仅为20个月（P＜0.05），提示TS基因型可以作为转移性结直肠癌患者生存的独立预后因素。Matsui等[8]对161例接受过5-FU辅助化疗的结肠癌患者进行了前瞻性分析，寻找TS基因多态性与化疗疗效之间的关系。结果发现11例患者（6.8%）TS基因型为2R/2R型，40例（24.8%）为2R/3R型，110例（68.3%）为3R/3R型。2R/2R型的所有患者在研究结束时仍存活，但与其他两种基因型相比却无统计学意义。据此推测，TS基因型为2R/2R的患者可以从基于5-FU辅助化疗中受益。
2DPD
DPD是5-FU代谢的限速酶,体内5-FU剂量的85%都是通过DPD代谢失活，DPD活性丧失将导致严重的5-FU相关毒性反应。
Kuilenburg等[9]研究发现接受含5-FU化疗的患者中DPD活性高低是影响5-FU毒性的重要因素之一。DPD基因（DPYD）到现在为止至少有20种突变与DPD活性降低和5-FU毒性反应有关。此后Kuilenburg[10]的深入研究表明,剪切位点突变IVS14+1GA,即14内含子5′剪切位点处GT突变为AT,导致DPD失活。这是最常见的导致5-FU严重毒性反应的基因突变。在该项研究中DPD活性下降的患者中28%为IVS14+1GA突变,而正常者只有4%的突变率,证明IVS14+1GA突变携带者具有发生DPD严重毒性反应的高风险。此外，DPYD等位基因突变的杂合子发生严重毒副反应的几率比纯和子高,但纯合子发生的毒副反应往往是致死性的[11]。
肿瘤细胞内DPD水平也是影响5-FU化疗疗效的重要因素,肿瘤细胞DPD活性和DPDmRNA表达水平与肿瘤的敏感性之间存在高度的相关性。Sato等[12]选取了8株肿瘤细胞，其中胆管癌细胞株通过基因修饰使DPDmRNA低表达，结果显示DPDmRNA与DPD活性存在明显相关性，且发现DPD活性低的胆管癌细胞对5-FU敏感性较高。Hasegawa等[13]也在对接受含5-FU化疗方案的晚期结直肠癌患者长期生存时间与DPD活性的研究中发现，DPD活性低的患者能够从含5-FU化疗中得到生存受益。
与5-FU共同组成联合化疗方案的化疗药物是否会影响DPD而导致5-FU毒性反应的改变，值得深入探讨。有学者应用5-FU与铂类、喜树碱类、紫杉类、丝裂霉素等联合干预结肠癌细胞，比较细胞中DPDmRNA表达情况，结果发现，所有化疗药物在与5-FU合用后均使得细胞中DPDmRNA的表达减少，具体机制尚不明[14]。
3OPRT
体内和体外实验研究显示OPRT是5-FU磷酸化的关键酶。在组织细胞内，5-FU被磷酸化后才能变成有活性的代谢物，进而通过抑制细胞DNA的合成和诱导RNA的功能障碍发挥作用。Mizutani等[15]在膀胱癌患者中发现OPRT高表达的患者比低表达者对5-FU有更高的敏感性，更易从5-FU的治疗中获益，这一结果提示OPRT表达水平是预测5-FU敏感性的一个因子。在接受含5-FU术后辅助化疗的胃癌患者中同样发现OPRT表达水平与5-FU敏感性密切相关[16]。OPRT存在多种基因多态性，如638GC、1050TA、1336AG等，但是研究发现OPRT多态性并未对5-FU敏感性产生影响[17]。
4嘧啶磷酸化酶（TP)
TP是5-FU前体药物卡培他宾(capecitabine)在体内转化为具有抗癌活性物质的关键酶,且与肿瘤细胞高复制、侵袭转移和肿瘤血管生成有关,并拮抗肿瘤药物的凋亡作用。
Xiao等[18]对70例结肠癌患者研究表明，TP阳性者比阴性者的5年生存率明显降低（33.33%vs73.33%，P＜0.0001）。但是,Yasuno等[19]对97例进展期结肠癌患者研究表明，肿瘤细胞TP阳性率为38%，间质细胞为49%，肿瘤细胞TP表达率与血管密度有关(P=0.051)，而间质细胞TP高表达者预后较好(P=0.0127)。Meropol等[20]利用免疫组化技术对转移性结直肠癌中肿瘤原发灶和转移灶中TP的表达水平与化疗敏感性及生存期之间的关系进行了研究，结果显示原发灶中TP的表达水平与化疗敏感性及生存期均有明显相关性，高TP表达提示更好的预后。
以上资料提示TP可能是结肠癌的重要预后因子,依据TP的表达水平可以预测转移性大肠癌化疗敏感性。
5亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)
MTHFR不可逆地催化5，10-亚甲基四氢叶酸(5，10-MTHF)，使其转变为5-甲基四氢叶酸，从而削弱了5-FU的抗肿瘤作用。MTHFR基因的多态性预测癌细胞对5-FU的敏感性可能具有较高的临床价值。
MTHFR基因多态性最常见的是第667位的密码子发生了由CT以及第1298位密码子发生了由AC的变异。Jakobsen等[21]在对139例接受含5-FU化疗的晚期结直肠癌患者的研究中发现，MTHFR基因第667位密码子为TT基因型者对化疗有较高敏感性。而Etienne等[22]采用5-FU干预19种人类肿瘤细胞，发现第1298位密码子突变型的C/C、A/C对5-FU药物的敏感性较高，而野生型A/A对5-FU药物敏感性明显低于突变型,可见MTHFR基因第1298位的密码子的多态性与5-FU的敏感性相关。
MTHFR基因的多态性对于预后的影响至今仍有争议。一项包含有1067例接受含5-FU化疗的乳腺癌患者的研究结果显示，MTHFR基因第667位CT的变异与进展期乳腺癌的长期生存时间相关，但与早期乳腺癌预后无明显相关性，其具体机制不明[23]。但是在2006年有两项研究[24-25]发现，对于接受含5-FU治疗的结肠癌和食管癌患者，其MTHFR基因的多态性与预后无关。
6尿嘧啶脱氧核糖三磷酸（dUTP）核苷酸水解酶（dUTPase）
TS活性抑制可致大量dUTP的积聚，dUTP直接掺入DNA，抑制DNA链的延长，还可以改变DNA的稳定性，继而引起DNA链断裂，最终导致细胞的死亡。dUTPase的过表达将限制dUTP的聚集，引起TS相关的细胞毒性药物的耐受；而dUTPase的低表达使得dUTP聚集，从而提高药物的敏感性。关于dUTPase与5-FU的敏感性关系的报道较少，Ladner等[26]发现肿瘤组织细胞核中dUTPase过度表达的患者对以5-FU为基础的化疗不敏感，疾病进展时间和生存期也较短。但是目前仍缺乏大样本的研究来证实此结论。
7展望
现阶段临床上进行化学药物治疗常见的难题是肿瘤耐药和化疗药物的毒性反应，未来化疗的最终目的是实现根据肿瘤的反应以及宿主毒性反应的个体化治疗模式。随着检测技术的进步和检测结果评价的标准化，可以通过对接受含5-FU化疗的患者相关药物代谢酶分子表型和肿瘤基因型进行分析，在给药前对患者进行药理学筛选，从而制定个体化治疗方案，达到最佳治疗效果。
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肺癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，约占癌症死亡者的1/3。据WHO统计，全球每年肺癌新发病人超过120万，死亡110万。在美国，2009年预计肺癌死亡人数和发病人数分别为16万和22万［1］；在我国，肺癌发病率及患病绝对人数均占全世界的第一位。肺癌早期发现、早期诊断仍然是医学界的一个重大难题。
病因学研究显示，暴露于相同环境致癌因素(如吸烟)的人群中只有一部分人会发生肺癌，说明不同个体对烟草等中致癌物的易感性不同；分子流行病学研究还发现，遗传倾向在大多数肺癌中可能充当一个重要角色，家族性研究表明发展成肺癌的危险性有一个巨大的遗传组分在终生不吸烟者、年轻个体中［2］；研究还表明人群中的许多基因都存在遗传多态性，这种多态性为个体肿瘤易感性的重要决定因素［3］。1抑癌基因Reprimo
抑癌基因Reprimo是细胞周期调控蛋白，基因定位于人类染色体2q23，人类和小鼠Reprimo蛋白同源性高达97%，均由109个氨基酸组成，相对分子质量在12kDa，为一种定位在细胞浆中的糖基化蛋白［4］。Reprimo基因可由X线照射后的细胞中分离出，是p53基因的下游靶基因，其功能与抑制细胞周期密切相关，异位表达的p53可诱导ReprimomRNA表达，过表达Reprimo引起细胞周期停滞于G2期，使细胞不能增殖，其机制可能是通过抑制Cdc2活性以及Cdc2/cyclinB1复合物核转位的途径来发挥对细胞周期的调节［4］。2抑癌基因Reprimo异常与癌症
抑癌基因Reprimo异常与机体癌症发生具有相关性。BernalC.等［5］在胃癌血浆发现Reprimo甲基化的样品很多，与无症状对照组比较有统计学意义(P
TakahashiT，［8］等检测645名肿瘤患者（代表16个肿瘤类型的肿瘤）Reprimo异常甲基化。Reprimo启动子甲基化在胃癌为79%，在胆囊癌症为62%，在淋巴瘤为57%，在大肠癌为56%，在食管腺癌为40%，在乳腺癌为37%，在白血病为31%。卵巢癌，膀胱癌，宫颈癌，脑瘤，恶性间皮瘤和儿科肿瘤中的甲基化频率都很低（0-20%）。在良性组织很少检测到reprimo甲基化（0-11%），胃黏膜上皮细胞除外。大肠息肉也经常检测到甲基化（27%），而慢性胆囊炎标本却很少（4%）。而且我们未能确定Reprimo在大肠癌和胃癌细胞系和50个主要大肠癌的基因突变。所以Reprimo异常甲基化与表达的缺失是一种常见的现象，并可能是导致某些类型的人类恶性肿瘤的发病机制。
SuzukiM，等［9］检测Reprimo异常甲基化在非小细胞肺癌（NSCLC）的细胞株为32%（6/19），在小细胞肺癌（SCLC）的细胞株为6%（1/16），在原发肿瘤为31%（51/167）。甲基化在正常淋巴细胞缺失，在相应的非恶性肺组织很少缺失（7%；4/57）。在细胞株，Reprimo表达缺失和异常甲基化之间的整体一致性为94%（33/35）。Reprimo表达缺失的五个细胞株经甲基化剂5-氮杂-2''-脱氧胞苷处理后reprimo表达恢复。在细胞株p53基因状态和Reprimo甲基化之间没有显著相关性。这些数据表明，Reprimo甲基化在肺癌频繁发生并独立于p53，Reprimo甲基化可能在肺癌的发病机制中发挥一定的作用。
国内也有王海等［10］胃癌与Reprimo，罗峻等［11］胃腺癌与Reprimo，姜蕊等［12］肺癌与Reprimo之间具有相关性的报道。
【关键词】偏头痛；MTHFD1基因；多态性；R134K；R653Q
StudyontheAssociationofPolymorphismsinMTHFD1GeneandtheHanNationalitywithMigraine/HEQing-song，ANXing-kai，FANGJie，etal.//MedicalInnovationofChina，2015，12（36）：012-015
【Abstract】Objective：TostudytherelationshipbetweenpolymorphismsinMTHFD1geneandthehannationalitywithmigraineinsouthFujian.Method：126patientswithmigraineinourhospitalwereselectedasthepatientsgroup，theyweredividedintothemigrainewithauragroup（MAgroup）andthemigrainewithoutauragroup（MOgroup）.116physicalexamineeswithoutmigrainewereselectedasthecontrolgroupatthesametime.Fluorescenceresonanceenergytransfertechnologywasusedtoexaminethegenotype.Therelationshipofdifferentgenotypesandmigrainewasanalyzed.Result：ThegenefrequencyoftheR134KandR653QinMTHFD1inpopulationofthetwogroupsfollowedtheHardy-Weinbergequilibrium.TherewerenostatisticallysignificantdifferencesingenotypicandallelicdistributionsofR134KandR653Qbetweenthepatientsgroupandthecontrolgroup（P
【Keywords】Migraine；MTHFD1gene；Polymorphisms；R134K；R653Q
First-author’saddress：TheFirstAffiliatedHospitalofXiamenUniversity，Xiamen361003，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.36.004
偏头痛是一种慢性、反复发作性的原发性头痛，其实质是一种神经生物功能失调性脑病，具有广泛的临床和遗传异质性，临床主要表现为中重度头痛发作，同时伴有恶心、呕吐、畏光、畏声及视觉症状等。根据先兆症状的有无，该病主要分为有先兆的偏头痛（migrainewithaura，MA）和无先兆的偏头痛（migrainewithoutaura，MO）。世界卫生组织2010年全球疾病负担调查显示偏头痛在全球最重的几项疾病负担中名列第7位，被视为20种最能致残的疾病之一[1]。我国的流行病学调查显示偏头痛涉及人群广泛，发病率与国外平均水平无明显差别，达到9.3%[2]。偏头痛频繁发作可导致患者劳动力丧失，学习及日常活动受限，生活质量下降，给社会和家庭造成沉重负担。偏头痛的确切病因目前还不十分清楚，可能是由多种遗传和环境因素共同作用所致。流行病学调查显示遗传因素在偏头痛发病中起着重要作用，呈多基因遗传模式，且MA的遗传倾向强于MO[3]。目前应用全基因组扫描分析，在欧美人群中发现约10个可能与偏头痛有关的基因[4-5]。对中国偏头痛人群的研究同样证实基因变异与偏头痛的发病有相关性[6]。这些研究有助于更好的理解偏头痛的发病机制。
笔者前期的研究曾经发现亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T多态性可能与闽南地区偏头痛患者存在相关性[7]。MTHFR主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸。而亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD）同样在叶酸代谢通路中有重要作用。目前澳大利亚一项研究提示MTHFD1基因R134K和R653Q位点可能与偏头痛无明显相关性，但西班牙一项研究发现MTHFD1基因R653Q位点增加了偏头痛发病风险，但目前我国尚无此类研究[8-9]。因此笔者在闽南汉族偏头痛人群中开展了偏头痛与MTHFD1基因多态性的关联性研究，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料本研究采用病例-对照研究方式，纳入偏头痛组及正常对照组。病例组来自就诊于本院神经内科头痛诊疗中心的偏头痛患者，诊断标准采用国际头痛分类第3版（ICHD-Ⅲ）偏头痛诊断标准[10]。每位患者均行颅脑CT/MRI等检查排除颅内占位、鼻窦炎等继发性头痛。对照组来源于同期体检中心就诊人员，每位人员均经神经内科医师采用调查问卷排除头痛等疾病。两组均排除合并肿瘤、免疫性疾病等的患者。两组均签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准，同时研究遵守相关医学法规。偏头痛组包括126例患者，其中男21例，女105例，平均年龄（36.29±11.35）岁，其中先兆偏头痛患者22例（MA组），无先兆偏头痛患者104例（MO组）。对照组包括116名年龄、性别、种族相匹配的健康无头痛人员，其中男19例，女97例，平均年龄（35.56±11.28）岁。两组性别、年龄方面比较差异均无统计学意义（P=0.952、0.619），具有可比性。
1.2方法
1.2.1DNA的提取取受试者外周血5mL，经二乙胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）抗凝，离心机分离白细胞，用DNA提取试剂盒（上海生工）提取基因组DNA，操作过程参考说明书进行，提取的全基因DNA放置于-80℃低温冰箱保存备用。
1.2.2基因分型本研究采用荧光能量共振转移（FRET）技术在罗氏实时定量PCR反应系统中进行基因型检测，引物和探针由上海生工公司合成，见表1。PCR反应在10?L体系中进行，包括DNA聚合酶0.05U/?L、MgCl23mmol/L，0.5?mol/L上下游引物，
1?mol/L的anchor探针和sensor探针，以及DNA模板50～70ng，以双蒸水调节总体积。PCR反应的条件：
94℃预变性2min，然后94℃10s58℃20s
72℃10s，共进行40个循环。单核苷酸多态性等位基因的荧光信号因为不同的解离温度产生不同的荧光信号，可以应用荧光计通道来分析。
1.3统计学处理本研究采用SPSS22.0软件包建立数据库并进行统计学分析，基因频率和基因型频率采用计数法计算；所有基因型的Hardy-Weinberg平衡检验均采用字2检验。计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用率（%）表示，比较采用字2检验，以P
2结果
2.1基因分型结果两组均得到了理想的DNA且经FRET技术均取得了良好的分型结果，见图1。R134K分型结果：纯合子TT的Tm值为62.0℃，纯合子CC的Tm值为67.5℃，杂合子CT的Tm值为62.0℃和67.5℃（图1A）。R653Q分型结果：纯合子GG的Tm值为65.0℃，纯合子AA的Tm值为68.0℃，杂合子GA的Tm值为65.0℃和68.0℃（图1B）。
图1MTHFD1基因多态性位点FRET基因分型图
注：图A为多态性位点R134K分型结果；图B为多态性位点R653Q分型结果；基线为未加DNA模板的参考对照
2.2基因型与偏头痛的关联性分析MTHFD1基因多态性位点R134K在对照组和病例组中的基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.797、0.241），同样R653Q的基因分布符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.281、0.963）。病例组与对照组R134K位点CC、CT、TT基因型频率及等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；病例组与对照组R653Q位点GG、GA、AA基因型频率及等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；MA、MO组基因型频率及等位基因频率分布与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。
3讨论
本研究通过大样本病例对照研究，未发现MTHFD1基因多态性位点R134K和R653Q与闽南地区汉族偏头痛患者存在关联性。进一步的亚组分析同样未能显示两者间有明显关联性。这与澳大利亚Sutherland等[8]开展的研究结果相同。西班牙Oterino等[9]的研究同样未能在病例对照研究中发现两者的关联性，仅仅在联合MTHFR基因C677T变异时显示出协同效应，因此笔者推测MTHFD1基因多态性可能与偏头痛无直接关联性。
高同型半胱氨酸血症已经在临床流行病学调查中被证实与偏头痛的发病有关系[11]。MTHFR是同型半胱氨酸代谢的关键酶之一，其基因变异可导致高同型半胱氨酸血症。笔者前期的一项大样本病例对照研究已经证实MTHFR基因C677T与闽南地区偏头痛有关联性[7]。叶酸参与氨基酸代谢，在甘氨酸与丝氨酸、组氨酸和谷氨酸、同型半胱氨酸与蛋氨酸之间的相互转化过程中充当一碳单位的载体，因此笔者推测叶酸的关键代谢酶亚甲基四氢叶酸脱氢酶1（MTHFD1）在偏头痛的发病中可能起重要作用。MTHFD1基因变异已经被证实与非综合征性唇腭裂、大肠癌、白血病等疾病存在相关性[12-14]。其基因变异导致10-甲基四氢叶酸合成酶的活性区域出现功能下降，会影响叶酸同型半胱氨酸代谢，导致核酸合成障碍和DNA的甲基化异常，最终引发产生染色体畸变[15]。本研究未能在偏头痛人群中发现这种关联性，说明MTHFD1基因变异导致的DNA功能障碍可能未影响到偏头痛相关基因通路。
荧光能量共振转移技术主要应用于膜功能、信号转导、细胞凋亡、基因检测等领域[16]。本研究采用FRET技术检测基因多态性，具有高通量、高精度、高准确性等特点，为开展类似研究提供了良好借鉴。笔者此前利用FRET技术检测儿童急性白血病的基因多态性即取得了良好效果[17]。说明这项技术应用于基因多态性检测具有实用性。
本研究在大样本研究中未能证实MTHFD1基因与闽南地区偏头痛存在明显的关联性，这是首次在闽南地区开展类似研究。但研究存在一定的局限性，如未能对MTHFD1基因其他变异进行分析，样本量偏小等。因此仍需要在更大人群规模、更广深度上进行进一步研究。
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【摘要】
目的了解宁夏回族甲硫氨酸合酶（MS）基因A2756G的多态性的分布特点。方法通过聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术分析200例宁夏回族MS基因A2756G基因型。结果宁夏回族人群中AA、AG、GG基因型频率分别为0.8100、0.1750、0.0150，G突变基因频率为0.1025。与白种人群中的分布差异有统计学意义（P＜0.05）。结论甲硫氨酸合酶基因A2756G基因型在不同种族间的分布存在明显的差异。
【关键词】甲硫氨酸合酶；多态性；回族
Abstract:ObjectiveToexplorethegenotypeandalleledistributionofmethioninesynthasegeneA2756GinHuiPopulation.MethodsGenotypesweredeterminedbyusingpolymerasechainreaction-restrictfragmentlengthpolymorphism(PCR-RFLP).ResultsMethioninesynthasegenetypefrequencyinNingxiaHuiwasAA0.8100，AG0.1750，GG0.0150.ThefrequencyofGwas0.1025，whichwassignificantlydifferentfromthatofwhitepeople（P＜0.05）.ConclusionTheMSgenesA2756GdistributioninHuiNationalityPopulationisdifferentfromthoseinotherareas.
Keywords:methioninesynthase;polymorphism;huipopulation
近些年来，与疾病相关的基因多态性越来越得到人们的关注，这些基因的多态性与疾病的发生发展有着密切的联系。有关高同型半胱氨酸（Hcy）代谢的关键酶如甲硫氨酸合酶（MS）、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与高脂血症关联性的报道，结论不一。目前发现的MS的变异体有十几种，这些突变点与某些疾病的易感性有着密切联系，不同的MS基因型可能导致其表达的酶蛋白功能上的差异，最终影响MS的生物学效应。本文对200例宁夏回族自治区人民医院体检的正常回族人MS基因A2756G多态性进行检测，为本课题组研究MS基因A2756G多态性与高脂血症的关系奠定基础。
1对象与方法
1.1对象
利用2007年1-7月间收集的200例宁夏回族自治区人民医院体检的正常回族人，男100例，女100例，年龄18～65岁。
1.2材料
取外周血3mL(肝素抗凝)采用北京赛百盛生物公司的硅胶膜基因组提取试剂盒提取基因组DNA，定量后稀释成100ng·μL-1，储存于-20℃备用。GoldenDNAPolymerase、2*ReactionMix、DNAMarkerD2000均购自北京天根生物公司；引物由北京奥科生物有限公司合成。
1.3PCR扩增及酶切
扩增MSA2756G位点引物［1］：上游：5'-CATGGAAGAATATGAAGATATTAGAC-3'、下游：5'-GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA-3'，PCR总反应体系25μL，含12.5μL2*ReactionMix、0.5UGoldenDNAPolymerase，上下游引物各10pmol，基因组DNA200ng，94℃预变性5min，94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃再延伸7min，取PCR产物5μL，用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳分析。取PCR产物10μL，加入内切酶HaeⅢ10U于37℃酶切过夜。酶切产物用3.0%琼脂糖凝胶电泳确定基因型。
1.4统计学方法
直接计数法计算MSA2756G基因型和等位基因频率，Hardy-Weinberg平衡定律加以检验，不同人群基因频率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1MSA2756G位点基因型检测结果
PCR扩增产物为189bp，酶切后，AA野生型表现为189bp；AG突变杂合子表现为189bp、159bp；GG突变纯合子基因型表现为159bp。AA、AG、GG基因型频率分别为0.8100、0.1750、0.0150，G突变频率为0.1025，见图1、表1。经χ2检验，宁夏回族群体MSA2756G基因型及等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性。
2.2宁夏回族人群MSA2756G与其他人群［2］的比较
见表1。表1宁夏回族人群MS基因A2756G与其它地区人群的比较（略）
由表1可以看出，宁夏回族与湖南、广东MS基因A2756G中G突变基因频率相近，而与白种人群的分布差异有统计学意义（P＜0.05）。
3讨论
甲硫氨酸合酶的主要生化功能是催化同型半胱氨酸再甲基化为甲硫氨酸，而甲硫氨酸又是人体必需氨基酸，参与人体重要的新陈代谢。人体内约有50多种物质需要S-腺苷甲硫氨酸（在转甲基之前甲硫氨酸与ATP作用生成）提供甲基，以生成甲基化合物，甲基化作用是一种重要的代谢反应，具有广泛的生理学意义。人MS基因定位于1q43［3］，编码区长3795bp，编码1265个氨基酸，编码蛋白的分子量为140kDa。目前人类发现MS基因突变有十余种，其中较常见第一突变位点是A2756G（D919G），甘氨酸取代天冬氨酸，产生一个HaeⅢ内切酶的位点；第二种突变是1个3bp的缺失，导致异亮氨酸的缺失；第三种突变位点是C2758G（H920G），从而失去了Sau96Ⅰ内切酶位点。
不同个体中存在的不同的MSA2756G基因型，有可能会导致不同个体MS基因的表达水平的不同［4］。S基因多态性与疾病的关系受到人们普遍的重视，LEIHuang等［5］研究认为MSA2756G是高脂血症的危险因素，此研究还需进一步验证。本研究显示，宁夏回族人群中以AA基因型较多，AG基因型次之，GG基因型最少。宁夏回族与湖南、广东MS基因A2756G中G突变基因频率相近，而与白种人群的分布差异有统计学意义。因此，MS基因的生物学作用在不同基因型个体的功能上可能存在较大的差异，这取决于环境、饮食、地域、种族、民族、性别等。
本文就宁夏回族人群与其他人群的MS基因A2756G多态性进行比较，结果发现MSA2756G的分布频率为0.1025，与国内其它民族的分布频率相近，而显著低于白种人群，且GG基因型较少，主要是以AG型突变为主，结果提示MS基因多态性的分布存在种族和民族之间的差异，对MS基因与一些临床疾病的个体化治疗提供理论依据，也为本课题组后期研究基因多态性与高脂血症的关系提供有价值的基础资料。
参考文献
［1］LinnebankM，FliessbachK，KolschH，etal.ThemethioninesynthasepolymorphismCG(D919G)isrelevantfordisease-freelongevity［J］.IntJMolMed，2005，16(4):759-761.
［2］李耀明，梁剑宁.广东汉族人蛋氨酸合成酶基因多态性［J］.中国优生与遗传杂志，2004，12（4）：38-39.
［3］LeclercD，CampeauE，GoyetteP，etal.Humanmethioninesynthase:cDNAcloningandidentificationofmutationsinpatientsofcb1Gcomplementationgroupoffolate/cobalamindisorders［J］.HumMoleGenet，1996，5(12):1867-1874.