舌癌以其浸润性强，转移速度快，治疗效果差等生物学特点颇受学术界关注。近年的研究［1－3］表明，在众多的组织学特征中，癌灶的浸润方式更能反映肿瘤的生物学行为。众所周知，肿瘤是细胞变异的结果，恶性肿瘤细胞无限制地生长、细胞核增大、核内染色质增多，其实质是细胞核内DNA不断复制的结果。国内外大量病理和临床资料已经证明，检测恶性肿瘤细胞DNA含量与倍体已成为目前研究肿瘤生物学特性及估计患者预后的热点问题。本课题拟从肿瘤－宿主边缘瘤细胞浸润分型出发，研究不同浸润方式舌癌细胞DNA倍体及细胞周期中S期细胞比例，从分子水平揭示舌癌生物学行为。
1材料与方法
1．1临床资料及标本处理收集兰州大学第二医院和西北民族大学口腔医院病历资料完整的病理确诊为舌癌的43例存档蜡块，所有患者术前均未行放化疗。其中男28例，女15例，年龄34～72岁。所有蜡块作5μm厚组织切片，行常规HE染色，阅片采用双盲法，由2位有经验的病理科医师按Anneroth等［4］介绍的方法浸润分型和肿瘤组织病理分级分类(WHO1997标准):Ⅰ型14例，Ⅱ型13例，Ⅲ型10例，Ⅳ型6例;病理分化程度:高分化23例，中、低分化20例。其中淋巴结转移17例，未转移26例。浸润分型后，所有蜡块重作50μm厚组织切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，胃蛋白酶消化，过滤，离心，漂洗，75%酒精固定，备检。
1．2单细胞悬液DNA荧光染色及上机检测备检样品离心、去上清、漂洗后用碘化丙啶(PI)一步插入性DNA定量荧光染色，4℃避光反应30min，用美国BECKMANCOULTE公司的EpicsXL型流式细胞仪上机检测，上机前需校正仪器，使其峰值的分辨率(CV值)在5%以内。以正常舌体组织作对照。
1．3分析指标用ModFitLT分析软件分析DNA倍体、细胞周期，依据DI值判定DNA倍体，0．9≤DI≤1．1为DNA二倍体;DI＜0．9或＞1．1为异倍体。DI=肿瘤细胞G0/G1峰道数/正常舌体二倍体细胞G0/G1峰道数，DNA异倍体的判定:在DNA直方图上出现明显的2个峰且异倍体细胞群至少应含20%的细胞或核同时DI＜0．9或DI＞1．1，同时测定SPF，SPF(%)=［S÷(G0/G1+S+G2/M)］×100%。
1．4统计分析采用统计学软件SPSS10．0对计量资料进行t检验，计数资料进行χ2检验。检验水准取α=0．05。
2结果
2．1浸润方式与淋巴结转移的关系根据临床病理资料统计，43例舌癌病例中有淋巴结转移者17例，其中Ⅰ、Ⅱ型浸润方式淋巴结转移者7例，阳性率为25．93%(7/27);Ⅲ、Ⅳ浸润方式型淋巴结转移者10例，阳性率为62．50%(10/16)。经统计学处理，Ⅰ、Ⅱ型与Ⅲ、Ⅳ型之间淋巴结转移率差异有统计学意义(P＜0．05)。
2．2浸润方式与肿瘤组织病理分化程度关系27例Ⅰ、Ⅱ型浸润方式者中，高分化20例，中、低分化7例;16例Ⅲ、Ⅳ型浸润方式者中，高分化3例，中、低分化13例。经统计学处理，Ⅰ、Ⅱ型和Ⅲ、Ⅳ型之间病理分化程度差异有统计学意义(P＜0．05)。
2．3浸润方式与DNA倍体、SPF之间的关系43例舌癌中，二倍体肿瘤18例，占41．9%，异倍体肿瘤25例，占58．1%，各浸润分型异倍体所占比例及SPF均值见表1。研究结果显示:随着浸润分型的发展，异倍体肿瘤检出率及SPF逐渐上升，经统计学分析，差异有统计学意义(P＜0．05)。
【关键词】紫杉醇;食管癌;凋亡;FADD
ExpressionOfFADDinducedbyPaclitaxelInEsophagealSquamousCellCarcinoma
WANGHongmei，YANGYubai.
TheCangxiPepole’sHospital,SichuanGuangyuan628400,China
【Abstract】ObjectiveToobservethechangesofFADDexpressioninesophagealcarcinomacell109(Eca109)inducebyPaclitaxel.MethodsWithdifferentconcentrationofpaclitaxel,theapoptosisratesofEca109cellsandproteinexpressionlevelsofFADDinEca109cellsweredetected.ResultsTheapoptosisratesofEca109cellswereincreasedwithconcentrationofpaclitaxelrising,andproteinexpressionlevelsofFADDinEca109cellswereincreasesimultaneously.ConclusionPaclitaxelinducedEca109cellapoptosisviachangingproteinexpressionlevelsofFADD.
【Keywords】Paclitaxel;Esophagealcarcinoma;Apoptosis;FADD
食管癌是常见消化道恶性肿瘤之一，其发病隐匿,确诊时大多已属于中晚期，使很多患者在手术前后需要接受化学治疗,以确保手术效果，同时化疗也为很多失去手术机会的患者提供了治疗的机会。紫杉醇品名为Taxol，最早是Wall和Wani于1963年从太平洋红豆杉的皮中提取得到［1］，经过临床试验后近年来已经广泛应用于临床包括食管癌在内的多种肿
瘤的化疗中。紫杉醇可作用于细胞凋亡受体途径的Fas/FasL通路或激活凋亡启动途径的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶系统(caspases),诱导细胞凋亡［2,3］，而FADD是Fas/FasL凋亡系统中的必需分子，不仅参与细胞凋亡过程的发生，还与细胞周期的调节有关。研究［4］证实从食管正常黏膜到不典型增生的组织中，FADD蛋白及mRNA表达呈现显著下降趋势。已有临床研究［5,6］表明紫杉醇联合顺铂、奈达铂、氟尿嘧啶等药物治疗食管癌,可以提高其总有效率,且毒副作用无明显增加，患者耐受性较好，表明紫杉醇在食管癌治疗中具有很高的临床应用价值。同时紫杉醇对人食管癌细胞的生长有明显的抑制作用,使细胞分裂阻滞于G2-M期,并诱导肿瘤细胞凋亡［7］。但现有研究并没有对这一过程中食管癌细胞中FADD的表达变化情况作进一步研究。
作者通过检测不同浓度紫杉醇诱导人食管鳞癌细胞株Ec-109细胞凋亡,并检测细胞表达FADD蛋白的变化情况，探讨紫杉醇抑制人食管癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的分子机制,为临床应用提供实验依据。
1材料和方法
1．1试剂与药物泰素(紫杉醇的商品名,由百时美施贵宝公司惠供,6g/L,分子质量8539u)，RPMI1640培养液、005%的胰蛋白酶及小牛血清为Hyclone产品,AnnexinV（FITC）/PI凋亡检测试剂盒购于杭州隆基生物工程研究所,蛋白提取液购于Pierce公司，兔抗人FADD单克隆抗体及鼠抗人β-actin单克隆抗体购于SantaCruz公司，考马斯亮蓝试剂盒购于南京建成生物科技有限公司。
1．2细胞与细胞培养人食管癌细胞株Eca-109（ATCC）由上海麦莎生物科技有限公司代购。细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液培养,生长于37℃含5%的CO2孵箱中,待细胞生长至对数生长期开始实验。胰蛋白酶消化细胞后培养基重悬，调整细胞数为5×10.5/ml接种于6孔培养板进行培养，24h后更换新鲜培养液，同时实验组培养液中分别加入终浓度为5、10、20、50nmol/L泰素，对照组不加药物，每个浓度设3个复孔，培养24h后收集各组细胞。
1．3凋亡检测
收集每组细胞后PBS洗涤离心，细胞重悬于300μlBandingbuffer中，加入5μlAnnexinV-FITC混匀，室温避光孵育15min，再加入5μlPI，室温避光孵育5min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率，同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为对照。
14Westernblotting分别收集每组细胞，PBS洗涤离心后，加入含蛋白酶抑制剂的蛋白提取液，提取细胞总蛋白并调整蛋白浓度后100℃煮沸变性。取适量蛋白进行SDS-PAGE电泳，半干法转膜，封闭，按1：1000分别孵育兔抗人FADD单克隆抗体及鼠抗人β-actin单克隆抗体，4℃过夜后洗膜，按1：1000分别孵育羊抗兔及羊抗鼠二抗，洗膜，化学发光底物显影照相后进行图片分析及数据采集。
1．5统计学方法
以上实验均重复3次，实验数据采用SPSS130软件分析处理，统计学方法采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，P
2结果
21紫杉醇诱导人食管癌细胞株Eca-109凋亡检测实验结果显示，实验组细胞凋亡率显著高于对照组，实验组中紫杉醇药物浓度5nmol/L组与10nmol/L之间差异无统计学意义，药物浓度升高至20nmol/L和50nmol/L后细胞凋亡率显著升高，与5nmol/L组和10nmol/L之间差异有统计学意义，见图1。
22细胞表达FADD蛋白水平检测检测结果显示，所有实验组中Eca-109细胞表达FADD蛋白水平较对照组均有升高，见图2，a。但仅紫杉醇药物浓度为20nmol/L组和50nmol/L组中细胞表达
FADD蛋白水平与对照组差异有统计学意义，见图2,b。
3讨论
研究结果显示，紫杉醇能诱导人食管癌细胞株Eca-109细胞凋亡，当紫杉醇浓度达到20nmol/L和50nmol/L时，细胞凋亡率显著升高。这一研究结果提示，只有紫杉醇达到一定血药浓度后，才会对食管癌细胞产生抗癌作用。低浓度紫杉醇作用可能只会抑制细胞增殖，并不一定能引起食管癌细胞的凋亡。FADD是FAS受体和部分TNF死亡受体家族成员介导信号通路中的胞质死亡信号衔接蛋白，其羧基端的死亡结构域DD与Fas分子胞浆段内的DD结合，当Fas与FasL结合导致Fas胞内的死亡域形成三聚体而活化,并引起与之结合的FADD构象改变,使Caspase-8前体集聚、断裂和激活,产生有活性的Caspase-8,从而激发一系列下游的Caspase-3等级联反应,诱发细胞凋亡［8］。检测结果显示，当紫杉醇诱导人食管癌细胞株Eca-109细胞凋亡时，细胞表达FADD蛋白水平显著升高，而低浓度组之间差异无统计学意义。这表明紫杉醇可能通过Fas/FasL途径在食管癌治疗中起作用，一定剂量的紫杉醇可以诱导食管癌细胞FADD表达水平的升高，促进癌细胞凋亡。这也提示在抗肿瘤治疗过程中，紫杉醇的用量也是关键。
食管癌的治疗是一个综合治疗的过程，化疗只是所有治疗方法中的一种。紫杉醇虽然在食管癌临床治疗中已经显现出一定的价值，但仍无法彻底改变食管癌疾病的预后。作者也仅仅选用了食管癌中的鳞癌细胞株作研究，还不能代表食管癌所有病理类型，将进一步深入研究，以期能为食管癌的治疗提供更为有价值的理论基础。
参考文献
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【关键词】rna,小分子干扰;血管内皮生长因子受体;pc3细胞;前列腺肿瘤
0引言
血管内皮生长因子受体ⅱ，又称激酶功能区受体(vascularendothelialgrowthfactorⅱ,vegfr2/kinasedomainreceptor,kdr)，其在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达，对于vegf的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用.研究表明，人前列腺癌细胞中有vegf和kdr表达，存在vegf?kdr自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关［1-2］.我们用psilencertm3.1?h1neo在前列腺癌细胞系pc3内表达针对kdr基因的短发卡状rna(shorthairpinsmallinterferingrna,shrna),阻断或降低细胞中kdr基因的表达，探讨kdr基因沉默后对pc3细胞增殖、生长的影响.
1材料和方法
1.1材料psilencertm3.1?h1neo质粒(美国ambion公司)；lipofectaminetm2000转染试剂(美国invitrogen公司)；pc3细胞株为本室保存；鼠抗人kdrmab,羊抗鼠二抗,dab显色液(武汉博士德公司)；gapdh内参及其mab(上海康成生物有限公司)；pegfpn2质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠.
1.2方法
1.2.1sirna靶序列的设计及其表达载体构建根据sirna设计原则［3］以及kdr(基因号af063658)选取并针对kdr基因编码区（a：395～414aacatggagtcgtgtacatta；b：2969～2988aagctcctgaagatctgtata；c：3906～3925aagcggctaccagtccggata），分别命名为（psilencer3.1?kdr1,psilencer3.1?kdr2,psilencer3.1?kdr3）,序列经同源分析后，由北京赛百胜公司合成.按操作说明将合成的dna变性、退火，形成的双链dna与psilencertm3.1?h1neo线性质粒连接，转化dh2α感受态细胞，lb平板（amp+）筛选阳性克隆，提取质粒进行bamhⅰ,hindⅲ双酶切及琼脂糖电泳鉴定，并提交大连宝生生物公司进行测序.
1.2.2sirna表达质粒转染pc3细胞提取测序正确的sirna表达载体和pegfpn2质粒并测定浓度.将pc3细胞按1×105/孔的数量转种于6孔培养板，sirna表达载体转染pc3细胞按操作说明进行，每孔质粒用量为2μg，脂质体用量为5μl.以任何已知序列不同源的shrna序列的质粒为阴性对照,以带有绿色荧光蛋白的pegfpn2质粒同步转染，荧光倒置显微镜于395nm检测转染效率.
1.2.3rt?pcr检测kdr的表达转染后48h，提取总rna并定量，用dna酶ι处理总rna以去除dna污染，取等量的rna反转录后进行pcr.psilencer3.1?kdr1位点pcr引物正义链：5′?gcccaataatcagagtggcagtg?3′，反义链：5′?gagacggactcagaaccacatca?3′，产物长度506bp；psilencer3.1?kdr2位点pcr引物正义链：5′?gcacgattccgtcaaggg?3′，反义链：5′?ttcaaagggaggcgagca?3′，产物长度383bp；psilencer3.1?kdr3位点pcr引物正义链：5′?acggacagtggtatggtt?3′，反义链：5′?cgagtcaggctggagaat?3′，产物长度279bp.内参照β?肌动蛋白pcr引物正义链：5′?gctcgtcgtcgacaacggctc?3′，反义链：5′?caaacatgatctgggtcatcttctc?3′,产物长度353bp.pcr产物经琼脂糖电泳后采用fr200图像分析系统分析.
1.2.4细胞总蛋白的提取及免疫印迹实验转染后72h提取细胞总蛋白并定量，调整蛋白浓度至相同水平进行sds?page电泳，转膜、封闭；鼠抗人kdr一抗1/1000，gapdh为1/1000，4℃过夜，加羊抗鼠二抗1/1000室温1h；洗涤、dab显色30min.采用fr200图像分析系统分析结果.
1.2.5免疫细胞化学染色及阳性分值的计算转染后72h的细胞爬片，经洗涤、固定，行kdr的免疫细胞化学染色，以pbs代替kdr抗体为阴性对照.每张染色片随机观察几个视野,计数100个细胞，染色深度以多数细胞为准.阴性细胞记0分,黄色记1分,棕黄色记2分,棕褐色记3分，合计即为该细胞的免疫细胞化学染色阳性分值，每种细胞计5次求均数.
1.2.6sirna转染后pc3细胞的生长曲线转染后24h，消化下各孔pc3细胞，按5×103/孔的数量转种于96孔板，设24,36,48,60,72,84h6个时间点，培养至各时间点，mtt法检测吸光度a值.
1.2.7细胞周期测定收集转染后72h的细胞，加预冷的无水乙醇快速混匀(乙醇终浓度为600ml/l～700ml/l)4℃固定lh;pbs洗涤2次，每次加洗液2.5ml左右，1000r/min离心5min；加100μlpbs调整细胞密度，每份样品为8×105个细胞,加入1mlpi染色液，室温下避光染色30min,300目滤网过滤于流式细胞分析样品管，以流式细胞仪检测dna?pi的荧光强度，结果采用modit软件系统进行析.
统计学处理：使用spss12.0统计分析软件，计量数据用x±s表示，对多组间均值比较行方差分析，两两比较采用lsd?t检验.p<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1sirna表达载体的构建酶切后的琼脂糖电泳图可见大小为66bp左右的酶切片段，与设计合成的kdr基因特异性序列大小相符（图1）.dna测序表明，各序列已成功插入了psilencertm3.1?h1neo载体.将各sirna表达载体分别命名为psilencer3.1?kdr1,psilencer3.1?kdr2和psilencer3.1?kdr3，阴性对照质粒命名为psilencer3.1?nc.
2.2转染效率的观察转染后24h，经荧光倒置显微镜下观察pegfpn2质粒同步转染的pc3细胞，结果显示，此次转染的效率约为65%.
2.3sirna对kdrmrna抑制作用与psilencer3.1?nc和未转染组pc3细胞相比，psilencer3.1?kdr3组pc3细胞的kdrmrna水平明显下调；psilencer3.1?nc、未转染组和psilencer3.1?kdr3的kdr灰度积分值分别为：189±4,191±4和104±3，而后者比前二者均低(p<0.01).psilencer3.1?kdr1和psilencer3.1?kdr2组pc3细胞kdr的mrna水平变化不明显.各组间β?肌动蛋白的mrna水平一致（图2）.
2.4sirna对kdr蛋白表达的抑制作用转染72h后，免疫印迹结果表明psilencer3.1?kdr3组，kdr蛋白总量明显下调，而其余各组蛋白总量水平无明显差异，各组gapdh的表达水平一致（图3）.免疫细胞化学染色结果表明psilencer3.1?kdr3组kdr阳性细胞减少，阳性分值减低.经方差分析5组之间差异有统计学意义(p<0.01)，经lsd?t检验，psilencer3.1?kdr3组与各组相比较，差异具有统计学意义(p<0.01)，而各组组间差异无统计学意义（表1）.
2.5sirna抑制pc3细胞的生长与对照组相比，psilencer3.1?kdr3组转染的pc3细胞的生长速度明显变慢，psilencer3.1?kdr1,psilencer3.1?kdr2转染组无明显变化（图4）.表1pc3细胞kdr蛋白免疫细胞化染色结果的比较
2.6sirna对pc3细胞周期的影响psilencer3.1?kdr3组g0/g1期细胞数较未转染组增加了18.33％，较psilencer3.1?nc组增加了11.41％；进入s期和g2m期的细胞数较未转染组分别减少了12.07％和6.26％，较psilencer3.1?nc组减少了8.21%和3.2％(表2,图5).表2sirna对pc3细胞增殖周期的影响图5流式细胞仪检测pc3细胞周期
3讨论
vegf与其受体在肿瘤血管形成中起着关键的调节作用［4-5］.vegfr家族的成员kdr是发挥功能的主要受体，不仅表达于肿瘤组织的血管内皮细胞而且表达于肿瘤细胞的胞膜和(或)胞质，这提示肿瘤细胞分泌的vegf不仅以旁分泌方式作用于血管内皮细胞并诱导血管新生，也可以通过自分泌途径与自身表面的受体结合而促进细胞生长或迁移、抑制细胞凋亡.witte等［6］制备的可与kdr特异性结合的mabdc101，在体外能抑制vegf与受体的结合，阻断vegf诱导的信号传导；bruns等［7］用dc101治疗前列腺转移直肠癌小鼠模型，发现该治疗不仅抑制小鼠肿瘤血管的生成，而且导致肿瘤内皮细胞的死亡，这些结果表明抑制肿瘤细胞细胞和?或肿瘤血管内皮细胞上vegf受体的表达，不仅可阻止肿瘤细胞的生长，也可抑制肿瘤血管的生成，从而阻断肿瘤的生长和转移.
本研究构建的三个针对kdr基因的sirna载体在前列腺癌细胞系pc3内表达了针对kdr基因的shrna，结果表明针对3号kdr基因位点的psilencer3.1?kdr3载体有效地抑制了pc3细胞中kdr基因和蛋白的表达.
schubert等［8］报道sirna的干涉效率是受靶rna的局部二级结构影响.psilencer3.1?kdr1和psilencer3.1?kdr2可能处于rna的局部二级结构或者是其大部分碱基对处于rna二级结构的“茎”位置，而psilencer3.1?kdr3可能是靶序列局部结构中的非配对碱基所占比例较大，则sirna易于与其结合，从而得到较好的干涉效果，而本研究sirna靶rna的局部二级结构的猜测，有待进一步证实.
虽然靶位点选择的成功与否与其在mrna中所处位置及二级结构密切相关，但是psilencer3.1?kdr3能够抑制pc3细胞中kdr基因和蛋白的表达，从而能够抑制vegf和kdr的结合，阻止肿瘤细胞生长、增殖.该策略，为肿瘤基因治疗奠定了基础，也为肿瘤血管抑制治疗提供了思路.
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【关键词】端粒酶肝癌反义寡核苷酸细胞凋亡
0引言
我国为肝癌高发国家，据统计肝癌位居男性肿瘤患者死亡原因的第二位［1］。肝癌的发生发展与端粒酶激活密切相关。端粒酶由三部分组成，即端粒酶rna、端粒酶逆转录酶和端粒酶相关蛋白。端粒酶在行使其功能合成染色体末端端粒序列时必须以自身的rna为模板［2］。端粒酶rna由450个核苷酸组成，其中11个核苷酸为端粒合成的模板序列。我们设想，封闭端粒酶rna的模板序列，干扰端粒酶向染色体末端添加端粒序列的过程,使癌细胞端粒长度的稳定机制破坏，就可使永生化细胞的癌细胞无限增殖受限，从根本上抑制肿瘤细胞生长。本实验目的在于观察靶向端粒酶模板区的硫代反义寡核苷酸对肝癌细胞端粒酶活性及肿瘤细胞生长的影响，为肝癌治疗探索一条新的、有效的途径。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株肝癌细胞株smmc²7721，正常肝细胞株l²02，购自中科院上海细胞生物技术研究所。
1.1.2trap反应试剂、tunel检测试剂、western单抗为宝灵曼公司产品。
1.1.3聚丙烯酰胺银染试剂硝酸银(agno3)，无水碳酸钠(na2co3)，购自华美生物公司。
1.1.4仪器beckmancs²15r低温离心机，perkin²elmergenepcr仪，mk²2酶标仪。
1.2方法
1.2.1端粒酶反义dna的设计选择近端粒酶rna模板区的20个核苷酸为反义靶位，设计合成端粒酶反义dna序列、正义序列、随机序列，见表1。硫代反义dna由中科院上海细胞所合成与纯化，纯度达98%以上。
表1端粒酶模板区反义、正义及随机序列（略）
tab1thesequenceofsense,anti²senseandcontrol²scrabled
1.2.2trap²pcr²elisa检测肿瘤细胞端粒酶活性［3］。
1.2.3合成dna对肝癌细胞端粒酶活性的影响1×106smmc²7721培养于nunclon24孔板，培养液1ml含10%热灭活小牛血清、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素，培养条件为37℃、5%co2。正义、随机、反义dna终浓度为10μmol/l，以pbs为对照，作用时间分别为12、24、36、48、60h，培养结束后胰酶消化，pbs洗2次，trap²elisa法定量测定端粒酶活性，每一dna设3复孔。进一步观察倍比稀释后的端粒酶反义dna（浓度为10、5、2.5、1.25μmol/l）作用不同时间对细胞端粒酶活性的影响。
1.2.4凋亡研究
(1)tunel染色观察细胞染色及细胞调亡4×105/ml培养细胞种植于12孔细胞培养板，不同寡核苷酸作用14天后pbs洗涤2次进行细胞爬片，按tunel试剂盒说明对细胞进行固定、通透、标记反应，苏木素染色，封片，拍照。
(2)流式细胞仪细胞周期分析1×104细胞经5μmol/l反义dna作用14天的细胞进行细胞周期时相分析。
(3)dna抽提及电泳将1×106经反义dna作用14天的细胞移入1.5ml离心管，加裂解液及蛋白酶²k，55℃水浴20min，加rna酶10μl作用2min，酚、氯仿²异戊醇各抽提1次，加3m乙酸钠、无水乙醇沉淀dna，3000g离心10min，气干，te溶解沉淀。取抽提好的dna5μl，在1.8%琼脂糖凝胶、5v/cm电压下，电泳3h，以hind²ⅲ酶切的λdna为分子标志，302nm紫外光透照并照相。
1.2.5western分析细胞周期相关蛋白收集经反义dna作用14天的smmc²7721肝癌细胞（以未作任何处理的smmc²7721阴性对照），裂解液裂解，蛋白产物进行sds²page电泳（15%浓缩胶，5%分离胶），电泳产物半干电转移至nc膜上（转移时间p21为45min，cyclind1、cdk2为1h），50g/l脱脂奶粉室温封闭4h，tbs漂洗3次，分别加入抗小鼠cyclind1，抗兔cdk2、p21单克隆抗体及作为内参照的β²actin单克隆抗体，4℃过夜反应，tbs漂洗3次，再加入相应二抗，室温反应4h，tbs漂洗3次后，dab显色。
1.3统计学方法
方差分析,p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1合成反义、正义、随机序列dna作用不同时间对肝癌细胞株smmc²7721端粒酶活性的影响
10μmol/l合成端粒酶反义dna对肝癌细胞端粒酶活性具有显著抑制作用，这种抑制作用开始于12h，60h端粒酶活性被完全抑制，而正义链及随机链对细胞端粒酶活性无显著影响，见表2、图1。
表2合成dna对smmc²7721细胞端粒酶活性的影响（1×106/ml）（略）
tab2theeffectionofsynthesiseddnaontelomeraseactivity（1×106/ml）
*：thedifferenceissignificantcomparedtothecontrol，p<0.01
a:controlscrambled;b:sense;c:anti²sense
图1端粒酶反义寡核苷酸对端粒酶活性的抑制作用（略）
fig1theinhibitoryeffectofanti²sensetelomeraseoligonucleotidefortelomeraseactivity
2.2反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用
2.2.1tunel标记在倒置显微镜下我们观察反义寡核苷酸作用14天的细胞，发现60%的癌细胞被染成棕色，并有凋亡小体的产生，凋亡细胞数显著高于正义序列，见图2。
a:anti²senselightmicroscope(×800)；b:senselightmicroscope(×400)
图2端粒酶反义及正义寡核苷酸作用14天tunel染色（略）
fig2tunelstainingforsmmc²7721afteranti²senseandsensetelomeraseoligonucleotideaffectedfor14days
2.2.2dna电泳反义寡核苷酸作用14天，光镜下癌细胞呈凋亡改变，dna抽提电泳出现凋亡条带，见图3。
a:genomic;b,c:anti²sense;d:sense
图3端粒酶反义寡核苷酸作用14天细胞dna电泳图（略）
fig3thednaelectrophoresisafteranti²sensetelomeraseoligonucleotideaffectedfor14days
2.2.3端粒酶活性与细胞周期的关系合成dna与1×104/ml细胞共育2周，反义dna在端粒酶活性被抑制后,s期细胞百分数下降,而g2/m期细胞百分数增高，细胞聚集于g2/m期，见表3。
表3端粒酶dna对细胞周期的影响（n=3）（略）
tab3theeffectionoftelomerasednaonthecellcycle（n=3）
*：thedifferenceissignificantcomparedtothecontrol，p<0.012.3细胞周期调控因子检测结果
反义寡核苷酸作用的肝癌细胞培养14天后收集裂解细胞总蛋白，以β²actin作内对照，westernblot技术检测cyclind1(细胞周期素)、cdk2(细胞周期素依赖性蛋白激酶)和p21（细胞周期素依赖性激酶抑制因子）的表达，结果显示在β²actin等量的情况下，与正义序列比较反义寡核苷酸作用的肝癌细胞cyclind1、cdk2的表达下降而p21蛋白的表达显著增加，见图4。
图4端粒酶反义dna作用后smmc²7721细胞周期相关蛋白的表达（略）
fig4theexpressionofcellcyclinaftertelomerase²antisensednaaffected
3讨论
我国为病毒性肝炎高发国家，病毒性肝炎相关肝硬化、肝癌的发生率居高不下。病毒感染可造成肝细胞变性坏死、假小叶形成。肝细胞在不断坏死及增殖过程中与病毒核酸整合而造成肝细胞端粒酶激活、无限增殖、永生化而恶变。因此，端粒酶激活在肝细胞癌变及其恶性增殖中起决定性作用［4］。端粒酶是核糖白复合体，主要功能是向分裂细胞染色体末端添加端粒重复序列以保证肿瘤细胞的无限增殖。
肿瘤细胞因端粒酶激活而恶性增殖，因此，用反义核酸来抑制或消除肿瘤细胞端粒酶活性成为近年肿瘤治疗研究的热点，核酸类药物抗肿瘤具有广泛临床应用前景［5］。研究指出：在寡脱氧核苷酸上通过共价连接引入一定的活性基团，可使该寡核苷酸耦合物除具有一般寡核苷酸特性外，其耐核酸酶能力、与靶核酸分子结合的强度及细胞对寡核苷酸摄取等均显著增强[6]，修饰的寡核苷酸被认为是选择性抑制基因表达的新工具和抗肿瘤治疗最有前途的新药。我们对靶向端粒酶模板区的反义dna的研究发现：反义dna能识别并与端粒酶模板rna结合而抑制肝癌细胞端粒酶活性，端粒酶活性的下降具有浓度依赖性，10μmol/l的反义dna作用12h即开始产生抑制作用，继续作用60h端粒酶活性几乎完全被抑制，实验中反义dna作用的时间延搁为12h，可能与其进入细胞的过程有关［7］。
随着肝癌细胞端粒酶活性的被抑制，肿瘤细胞出现生长阻滞，因此，端粒酶反义dna抑制肿瘤细胞增殖是通过抑制其端粒酶活性实现的。肝癌细胞端粒酶活性的抑制，意味着癌细胞失去了赖以永生化的物质基础而转为“非永生化”。
凋亡研究结果显示:端粒酶失活的癌细胞继续培养，细胞活力显著下降并出现调亡。端粒酶反义dna与肝癌细胞共育14天后，tunel染色60%的癌细胞被染成棕色，形态学上表现核深染、染色质边集、核碎裂及凋亡小体形成；细胞dna电泳呈凋亡特征性ladder，流式细胞仪研究显示s期细胞的百分数显著下降，说明发生凋亡的细胞为处于细胞周期s期的细胞[8]。
western杂交结果显示反义dna作用的肝癌细胞cdk2、cyclind1的表达量下调而p21表达增加。这就意味着端粒酶反义dna通过对端粒酶活性的抑制而影响了细胞p21的表达。有研究表明细胞周期监控机制的破坏可导致细胞基因组不稳定和基因突变，肿瘤细胞cyclind1的过度表达可缩短肿瘤细胞g1期使细胞持续生长，而p21的高表达则抑制肿瘤增殖并促进其发生分化[9]，p21能与cdk2结合形成稳定的复合物，阻止其与cyclind1的结合。我们所合成的端粒酶反义dna有可能通过细胞周期因子cyclind1、cdk2和p21的调控来抑制肝癌细胞的增殖。
端粒酶反义dna分子特异地与细胞内端粒酶rna结合，但对染色体端粒酶基因并无封闭作用，因此，反义dna对端粒酶活性的抑制是可逆的。我们将去除反义分子的细胞继续培养20天，端粒酶弱表达且不能恢复到原来的水平，发生这种现象的原因可能与下列因素有关：（1）进入细胞内的反义dna有足够量结合新转录的端粒酶rna模板序列；（2）端粒酶发挥作用必须以全酶的形式，端粒酶蛋白质成分在端粒酶活性调控中起主要作用，反义分子与端粒酶rna结合后可影响其蛋白质亚单位的构象或功能而影响端粒酶活性，即使细胞端粒酶rna基因有转录，其蛋白质成分也不能发挥作用；（3）端粒酶在细胞内被灭活后,肿瘤细胞自身也发生了一系列的变化，如分化、老化及凋亡，端粒酶活性均显著降低［10］。
总之，我们的研究表明，端粒酶反义dna能抑制肝癌细胞端粒酶活性，并通过此途径抑制肝癌细胞增殖、使s期细胞凋亡。靶向端粒酶的核酸类药物有潜在临床应用前景，值得进一步研究。
【参考文献】
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［3］邓志华，韩子岩，王琦，等.抑制端粒酶活性对as2o3诱导肝癌细胞凋亡的影响［j］.中国肿瘤生物治疗杂志，2006，13（6）：457²461.
【摘要】
目的:采用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体内外抑制含激酶插入区受体(KDR)基因表达，探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰（RNAi）技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性。方法:采用阳离子脂质体Lipofectamine2000TM作为转染试剂将针对人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF7，诱导RNAi，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法，RTPCR，Westernblot试验等检测KDR基因和蛋白表达及细胞增殖变化。采用阳离子聚合物纳米粒InvivojetPEITM为转染试剂将siRNA直接注射进裸鼠移植瘤，监测肿瘤生长变化，RTPCR，免疫组化方法等监测KDR基因和蛋白表达变化。结果:靶向KDR基因siRNA转染MCF7后，细胞增殖被抑制，KDRmRNA和蛋白的表达明显降低;裸鼠体内实验显示siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;RTPCR，免疫组化结果同时表明治疗组KDR表达下调。各对照组指标无明显变化。结论:化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功抑制靶基因的表达和MCF7细胞增殖，是潜在的肿瘤治疗新方法，而KDR亦可作为肿瘤治疗的新靶点。
【关键词】RNA干扰siRNAMCF7细胞血管内皮生长因子受体2基因治疗
[Abstract]AIM:Toinhibitkinaseinsertdomaincontainingreceptor(KDR)expressionchemicallymodifiedsiRNAinvitroandinvivoandtoinvestigatethefeasibilityandspecificityofgenetherapyforbreastcancer.METHODS:Invitro，siRNAwastransfectedintoMCF7cellstoinduceRNAibyusingcationicliposomeLipofectamine2000TM.ThechangesofKDRmRNAandproteinexpressioninbothsiRNAtreatmentgroupandcontrolgroupweremeasuredbyMTTassayandRTPCR，Invivo，thesiRNAwastransfectedintotransplantedtumorinnudemicebyusingcationicpolymernanoparticleInvivojetPEITM.Tumorgrowthwasobserved.ThemRNAandproteinexpressionofKDRwasmeasuredbyRTPCRandimmunohistochemicalstaining.RESULTS:ExperimentsinvitroshowedthatsiRNAdirectedagainstKDReffectivelyinhibitedtheproliferationofMCF7cellsanddownregulatedKDRmRNAexpression.Invivo，thegrowthoftumorwasvisiblysuppressed.Furthermore，RTPCRandimmunohistochemicalresultsindicatedthatKDRmRNAandproteinexpressionwasreducedinexcisedtumors.CONCLUSION:RNAimediatedbychemicallymodifiedsiRNAmarkedlydecreasedKDRgeneexpressionandinhibitedcellularproliferation.Itmayhavethepotentialasatherapeuticmethodtotreathumancancer.
[Keywords]RNAi;siRNA;MCF7;VEGFR2;genetherapy
恶性肿瘤生长过程中，肿瘤组织内细胞急剧、持续性增殖的病理生理学基础是肿瘤组织内血管的再生。有研究认为，含激酶插入区受体(kinaseinsertdomaincontainingreceptor，KDR)，即血管内皮生长因子受体2（vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，VEGFR2）在血管内皮和部分肿瘤细胞，包括乳腺癌细胞上特异性表达，对于VEGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用[1]。肿瘤细胞分泌VEGF，除了以旁分泌的形式作用于血管内皮上的KDR，促进血管形成外，还以自分泌的方式作用于自身细胞上的KDR，直接促进肿瘤细胞生长[2，3]。所以，抑制KDR的表达，可以在两个水平上抑制肿瘤生长。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一项新兴的基因治疗技术[4]，是将双链RNA（dsRNA）导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程。siRNA(smallinterferenceRNA，siRNA)是RNAi的效应分子。我们依据RNAi原理，设计合成以KDR为靶的siRNA，并对其进行化学修饰，增强其在体内外的稳定性，并以人类乳腺癌细胞株MCF7为研究对象，在体外细胞水平及裸鼠动物水平，探讨siRNA对KDR基因特异性沉默及对细胞和瘤体增殖的抑制作用。
1材料和方法
1.1材料乳腺癌MCF7细胞株购自中国协和基础学院细胞中心，常规培养于含100mL/L胎牛血清的高糖DMEM(Gibco公司产品)培养液中，50mL/LCO2、37℃饱和湿度的孵箱中培养传代。BALB/cnu/nu裸小鼠（雌性，4周龄，体质量12～14g），购自上海斯莱克动物有限公司，按规定饲养于无菌动物试验室，经高压灭菌的标准饲料和水供动物自由饮食。LipofectamineTM2000及TRIzol为Invitrogen公司产品;InvivojetPEITM为PolyPlus公司产品;AMV逆转录试剂盒购自Promega公司;鼠抗flk1多克隆抗体（sc6251）为santacruz公司产品;免疫组化检测试剂盒PV6002购自北京中杉公司;ECL发光试剂购自北京普利莱公司。
1.2方法
1.2.1siRNA设计合成从美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取人KDRmRNA的序列全长(GI:11321596)，利用siRNA在线设计软件及RNA二级结构分析软件structure4.4，将随机设计的siRNA与预测的mRNA二级结构对比，选择出一条与预测的KDRmRNA容易结合的siRNA，其KDRsiRNA序列为:5′GCCACCAUGUUCUCUAAUATT3′(正义链)，5′UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT3′(反义链);阴性对照siRNASCR（scramblesiRNA）序列为5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3′(正义链)，5′ACGUGACACGUUCGGAGAATT3′(反义链)。两段siRNA序列均行BLAST对比确保与其他基因没有同源性。为增强siRNA的稳定性，对正义链进行氟代修饰，反义链不修饰，由上海吉玛化学修饰合成。
1.2.2转染根据Lipofectamine2000TM试剂操作指南，采用通用型荧光标记的阴性对照siRNA进行转染条件的优化。取对数生长期的MCF7细胞，调整细胞密度，接种于12孔板，用含100mL/L血清不含抗生素的DMEM培养，次日细胞贴壁后弃去旧培养液待转染。siRNA与Lipofectamine2000TM分别用适量不含血清和抗生素的DMEM稀释，5min内将其混合，室温静置20min后加入细胞孔中，细胞置于培养箱常规培养，6h后荧光显微镜下观察。选用siRNA与Lipofectamine2000TM最佳转染比例。
1.2.3MTT法测细胞增殖收集对数生长期细胞接种于96孔板，细胞汇合度达90%后，设立空白对照组（只加无血清无抗生素培养基），脂质体组（只加LipofectamineTM2000，0.5μL/孔），4个siRNA浓度梯度组（25、50、100、200nmol/L），siRNASCR组（100nmol/L），每组6个平行孔，每孔终体积100μL，按上述方法进行转染。置37℃，50mL/LCO2孵箱中培养48h后加MTT(5g/L)20μL/孔，继续孵育4h，弃上清，加DMSO100μL/孔，振荡10min，使结晶充分溶解，在酶联仪492nm波长处测各孔的A值，以公式（1－A/C）×100%计算siRNA对肿瘤细胞的生长抑制率（A，C分别为给药组细胞和对照组吸收度平均值），数据进行统计学分析。
1.2.4半定量RTPCR检测KDRmRNA的水平收集转染24h细胞，按照TRIzol试剂盒操作说明提取细胞总RNA，所提RNA溶于20μL无酶水中，Eppendorf核酸定量测定仪测RNA浓度和纯度，并行8g/L琼脂糖凝胶电泳，观察RNA完整性。将1μg总RNA行20μL体系逆转录反应，取cDNA后续25μL体系PCR反应，并以无酶水作为阴性模板对照。PCR反应条件为:94℃预变性5min，94℃变性45s;64℃退火45s;72℃延伸2min。35个循环后72℃延伸7min。KDR上游引物:5′CTGGCATGGTCTTCTGTGAAGCA3′，
下游引物:5′AATACCAGTGGATGTGATGCGG3′，扩增产物795bp;内参照GAPDH上游引物:5′CGTGGAAGGACTCATGACCA3′，下游引物:5′TCCAGGGGTCTTACTCCTTG3′，扩增产物为509bp。PCR产物在20g/L的琼脂糖凝胶电泳上观察拍照，并运用天能分析软件对条带进行光密度扫描，检测各组KDRmRNA扩增产物与其对应的内参GAPDHmRNA扩增产物A值，然后将AVEGF/AGAPDH的比值进行统计学分析。
1.2.5裸鼠体内抑瘤试验（1）动物模型的建立:参照文献[5，6]方法，选4周龄BALB/cnu/nu裸鼠，每周2次腹腔注射苯甲酸雌二醇10mg/kg，连续2周。取对数生长期的MCF7细胞经胰酶消化后，用Hank液清洗2次，在细胞记数板上作细胞记数，并调节使活细胞密度为5×1010/L，于裸鼠右侧腋窝偏背部接种0.1mL/只（含细胞5×106个）。(2)分组及给药:以瘤体直径≥5mm为成瘤阳性，将成瘤阳性的裸小鼠随机分为4组，每组5只。进行瘤内给药。对照组:仅注射50g/L葡萄糖溶液;脂质体处理组:注射invivojetPEITM和50g/L葡萄糖溶液;小剂量KDRsiRNA处理组:注射KDRsiRNA（0.5mg/kg），invivojetPEITM和50g/L葡萄糖溶液;大剂量KDRsiRNA处理组:注射KDRsiRNA（1mg/kg），invivojetPEITM和50g/L葡萄糖溶液。KDRsiRNA与invivojetPEITM比例按操作说明进行，终体积均为100μL。每3d注射1次，连续8次。裸鼠按规定饲养于无菌动物试验室，按公式V=0.5a×b2(V代表瘤体积，a为长径，b为短径)每3d测量瘤体积，绘制瘤体增长曲线。22d后拉颈处死裸鼠，分离得瘤体，部分瘤组织加入液氮匀浆提取RNA。部分入100mL/L中性福尔马林中固定，依次进行系列梯度脱水、浸蜡、包埋及切片(厚度4μm)后，按常规进行HE染色，免疫组化染色按试剂盒说明采用两步法，标本微波修复，一抗flk1浓度为1∶300，于光镜下观察结果。
1.2.6统计学处理数据用x±s表示，经SPSS12.0统计软件分析，多组间差异显著性检验用单因素方差分析，两组间比较用t检验。
2结果
2.1KDRsiRNA的设计根据人KDRmRNA的序列，利用siRNA在线设计软件及RNA二级结构分析软件structure4.4，将随机设计的siRNA与预测的mRNA二级结构对比，选择出一条与预测的KDRmRNA容易结合的siRNA，其KDRsiRNA序列为:5′GCCACCAUGUUCUCUAAUATT3′(正义链)，5′UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT3′(反义链)。
2.2MTT比色法检测siRNA对肿瘤细胞生长抑制作用转染KDRsiRNA48h后，MCF7细胞增长明显减慢，MTT数据统计处理结果显示:KDRsiRNA4个浓度组A值与脂质体组比较有统计学意义（P0.05）。100nmol/L组和200nmol/L组比较无统计学意义。这表明:KDRsiRNA对细胞增殖的抑制作用，在一定范围内抑制率随着浓度增加而增加，达到一定浓度后，再增加siRNA浓度并不提高沉默作用。各组A值及抑制率数值（表1）。
表1MTT比色法检测MCF7转染siRNA48h后增殖情况（略）
Tab1DetectionofproliferationofMCF7cells48haftersiRNAtransfectionbyMTTcolorimetry
bP
2.3RTPCR检测KDRmRNA表达的变化与未转染组比较，脂质体组与错义序列组无统计学意义;KDRsiRNA50nmol/L、100nmol/L和200nmol/L3组数据均有统计学意义（P
图1RTPCR检测转染siRNA后MCF7细胞KDRmRNA表达水平（略）
Fig1ExpressionofKDRmRNAinMCF7cellstransfectedwithsiRNAmeasuredbyRTPCR
RnasefreewaterwasusedasnegativePCRcontrol;GAPDHwasusedasacontrol.M:DNAmarkers;1:Rnasefreewater;2:50nmol/LKDRsiRNAgroup;3:100nmol/LKDRsiRNAgroup;4:200nmol/LKDRsiRNAgroup;5:TransfectedwithsiRNASCRgroup;6:TransfectedwithLipofectaminegroup;7:Nontransfectedgroup.
2.4裸鼠体内试验
2.4.1裸鼠皮下移植瘤体积监测用药21d后，全部裸鼠均存活。与对照组比较，小剂量和大剂量KDRsiRNA处理组移植瘤增长趋势均受抑（P
2.4.2半定量RTPCR分析结果与对照组比较，大、小剂量KDRsiRNA治疗组明显下调了KDRmRNA的表达（P
2.4.3肿瘤组织形态学改变和KDR表达变化HE染色见肿瘤细胞呈上皮性，巢状排列，KDRsiRNA治疗组(图4A)与对照组(图4B)相比，可见大片细胞坏死，说明肿瘤细胞增殖受到抑制，生长不良。免疫组化染色显示KDR的阳性物质为棕黄色细颗粒，主要定位于肿瘤细胞的细胞膜、细胞质中，其阳性细胞呈弥漫性或局灶性分布。KDRsiRNA治疗组(图4C)相对于对照组(图4D)，染色阳性细胞明显减少。
图2不同处理组用药后裸鼠皮下移植瘤平均体积增长趋势图（略）
Fig2Thegrowthcurvesoftumorsaveragevolumesindifferentgroupsaftertreatment
A:Controlgroup;B:Transfectingagentgroup;C:Smalldoestreatmentgroup;D:Bigdoestreatmentgroup.Asshowninthefigure，thegrowthoftumoringroupstreatedwithsmallorbigdoseKDRsiRNAisobviouslysuppressed.Thegrowthoftumorinbigdosegroupismoreslowlythanthatinsmalldosegroup.
图3不同处理组移植瘤RTPCR结果（略）
Fig3KDRmRNAexpressioninexcisedtumorsofdifferentgroups
M:DNAmarker;1:50g/Lglucosecontrolgroup;2:InvivojetPEITM;3:SmalldoseKDRsiRNA;4:BigdoseKDRsiRNA.
图4不同处理组肿瘤组织HE及免疫组化染色（略）
Fig4HEandimmunohistochemicalstainingoftumortissuesindifferentgroups（originalmagnification，×800）
A，C:BelongtothegrouptreatedwithbigdoseKDRsiRNA;B，D:Belongtothe50g/Lglucosecontrolgroup.HEstainingshowedthattherewerelargeareasofcytoclasisinthecenteroftumorsinthegrouptreatedwithKDRsiRNAs(A)comparedwiththecontrolgroup(B).IHCanalysisshowedthatKDRimmunoreactivitywaswidelyexpressedinthecellmembraneandcytoplasminthecontrolgroup(D).Inthecontrast，inKDRsiRNAtreatmentgroup（C），theimmunoreactivityisdecreasedsignificantly.
3讨论
血管内皮生长因子（VEGF)及其受体（VEGFR）在乳腺癌生长、浸润及转移中发挥重要作用。已发现的VEGFR有3种:VEGFR1（FLT1）、VEGFR2（FLK1、KDR）和FLT4，但在细胞生长和分化中起重要作用而与血管生成有关的主要是FLK1(KDR)[7]。很多研究是将VEGF作为靶基因[8]，并且多是探讨其在血管生成中的作用，对癌细胞自身作用探讨较少。近年新的研究表明，VEGFR2(KDR)在人类多种恶性肿瘤包括乳腺癌细胞均有较高水平表达，并以自分泌作用于肿瘤细胞，促进其生长[9]。本实验室前期研究也发现KDR在MCF7乳腺癌细胞上有表达，因此我们选用MCF7作为研究对象，探讨抑制KDR对肿瘤增长的影响。
小分子干扰RNA（siRNA）是RNAi的效应分子，由两条互补RNA单链构成，包括5′磷酸端、19个核苷酸的双链区、3′羟基端和2个不配对的3′端核苷酸突起，可指导mRNA的裂解。但siRNA稳定性较差，易被核酸酶降解，因而在体内的应用受到了限制[10]。本实验中我们运用RNAi技术，进行了两方面改进:（1）对siRNA进行化学修饰。在核糖2′位置引入某些取代基如氟后，使siRNA具有更强的抵抗核酸酶的性能。细胞转染试验和小鼠体内试验发现2′FsiRNA与2′OHsiRNA的基因沉默效应无明显差别[11]。另外，siRNA反义链3′端的突起起识别与结合靶mRNA的作用，该处的化学修饰明显降低了RNA干扰的程度，而对正义链修饰较少影响siRNA活性。因此，我们选择对正义链氟代修饰，反义链不修饰的方法，既增强siRNA体内抵抗核酸酶的能力，又保证了作用的特异性。（2）运用合适的体内转导系统。我们采用聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）作为siRNA导入载体，PEI是一种阳离子聚合物纳米粒，较脂质体或病毒载体，减少了细胞毒性，也避免了病毒载体潜在的免疫原性和致瘤性问题。PEIsiRNA生物体内给药系统，已经被很多研究证明是抑制特定基因表达的理想工具[12]。
体外实验以阳离子脂质体为转染试剂，优化转染条件得到siRNA与Lipofectamine2000TM最佳质量体积比为10pmol∶0.5μL。MCF7细胞转染KDRsiRNA后，MTT证实其对细胞增殖的抑制，并从mRNA和蛋白水平均检测到siRNA对靶基因的沉默效果。体内实验，我们运用PEI阳离子聚合物纳米粒，siRNA与InvivojetPEITM最佳质量体积比为10μg∶1.8μL包裹siRNA，以50g/L葡萄糖溶液作为稀释液，直接注射瘤体内。结果表明，KDRsiRNA治疗组裸鼠生长状态良好，肿瘤增长缓慢，从瘤体提取mRNA和免疫组化染色，分别从基因和蛋白水平检测到KDR基因表达的下调。
综上所述，本研究结果表明:对KDRsiRNA进行有效化学修饰，并运用合适的转导系统导入细胞及裸鼠体内，能够有效降低KDR基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖。可作为肿瘤基因治疗的新途径，而KDR亦可作为肿瘤治疗的新靶点。
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【摘要】目的探讨PI3K/Akt抑制剂LY294002〔2（4吗啉基）8苯基4氢1苯并吡喃4酮〕联合化疗药物顺铂（DDP）治疗肺癌的效应及可能机制，以期为肺癌的临床治疗提供新的理论依据。方法培养肺腺癌A549细胞，采用MTT方法及流式细胞仪检测LY294002联合DDP对A549细胞增殖及凋亡的影响；通过裸鼠移植瘤实验检测LY294002联合DDP对A549细胞成瘤性的影响。结果在一定剂量范围内，LY294002与DDP均可抑制A549细胞的生长，其抑制作用呈量效关系。LY294002与DDP联合作用可增强对A549细胞的抑制作用。LY294002与DDP均可有效的诱导A549细胞凋亡，联用后凋亡率显著增加。裸鼠移植瘤实验显示，LY294002与DDP均可抑制移植瘤的生长，联用后抑瘤率增加。结论LY294002可增强DDP对A549细胞、裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用，该作用可能是通过增强对A549细胞增殖的抑制以及诱导其凋亡来实现的。
【关键词】肺肿瘤；凋亡；PI3K；LY294002；顺铂
细胞生存信号的转导对肺癌的发生发展起着至关重要的作用。PI3K/Akt信号转导通路在国外被视为癌细胞存活的首要通路。近年来对Akt的研究发现，Akt能够通过磷酸化其下游的多种作用底物促进对化疗和放疗的抵抗。PI3K/Akt抑制剂LY294002〔2(4吗琳基)8苯基4氢1苯并毗喃4酮〕可增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗〔1，2〕。而LY294002对肺癌的研究还处于初始阶段，本研究旨在对PI3K/Akt的抑制剂LY294002与化疗药物顺铂（cisplatin，DDP）联用对肺癌细胞株A549及裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其机制进行探讨，为肺癌治疗提供实验依据。
1材料与方法
1.1细胞株与试剂人肺腺癌细胞株A549购自中科院上海细胞生物研究院；F12K培养基、LY294002及噻唑蓝(MTT)购自sigma公司；胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所；DDP（云南个旧生物药业有限公司，国药准字@53021740）；裸鼠由北京大学医学院实验动物中心提供。
1.2细胞培养A549细胞用F12K培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养。细胞为贴壁生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.3MTT比色分析法检测LY294002对A549细胞生长抑制作用。取对数生长期A549细胞按1×104/孔接种于96孔培养板，每孔加液量200μl。于培养24h后换液，设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加不同浓度的DDP，DDP浓度依次为0.5、1、2、4、8、16μg/ml，每组LY294002终浓度分别为20μmol/L)，每组设6个复孔。于培养48h后加入MTT(5g/L)20μl，继续培养4h后吸出上清，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150μl，振荡溶解10min，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长490nm，空白孔调零，测定各孔吸光度A。计算细胞生长的抑制率，抑制率=(1-实验组A平均值/对照组A平均值)×100%。
1.4流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率的变化取对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为2×105/ml接种于培养瓶，加入上述不同浓度的药物（LY294002终浓度为20μmol/L，DDP终浓度别为3μg/ml），培养48h后获取细胞，制成单细胞悬液，4℃70%冷乙醇固定，放置4℃冰箱固定12h以上。检测时，弃去乙醇，加入0.5%胃蛋白酶1ml（pH值1.5～2.0）消化，采用碘化丙锭（PI）一步插入性DNA定量荧光染色法，上机检测细胞周期和细胞凋亡率。
1.5裸鼠移植瘤模型的建立与干预24只裸鼠，均为雌性，鼠龄为3～4w，体重约18～20g，实验和饲养均在无特定病原（SPF）条件下进行。随机将裸鼠分为4组：对照组、LY294002组、DDP组和LY294002+DDP组，每组6只，于裸鼠右上背部皮下接种对数生长期的A549细胞1×107/0.2ml。待1w后肿瘤长出。①LY294002组：给予LY29400225mg/kg，腹腔注射，每周2次；②对照组：等量生理盐水，腹腔注射；③DDP组：给予DDP4mg/kg，腹腔注射；④LY294002＋DDP组：LY29400225mg/kg＋DDP4mg/kg，腹腔注射；共3w。裸鼠于最后注射药物2d后处死，用药3w。实验中注意观察裸鼠精神、进食、排便及体重情况，隔日测裸鼠体重及移植瘤直径。实验结束取出移植瘤，注意肿瘤转移情况，称重瘤结节，计算抑瘤率：抑瘤率（％）＝（对照组瘤结节重量-各实验组瘤结节重量）/对照组瘤结节重量×100％。取LY294002组及LY294002＋DDP组裸鼠肝、胃及肠做HE染色。
1.6统计学方法计量资料用x±s表示，用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析和Pearson相关分析，率的比较采用χ2检验。
2结果
2.1LY294002联合DDP对A549细胞生长的抑制效应MTT结果显示：LY294002浓度分别为5、10、20、40μmol/L时，其抑制率分别为：26.94％、34.33％、42.53％、49.88％，可见在一定的浓度范围内，随着LY294002剂量的增加，其抑制率增加。根据LY294002对A549细胞的抑制效应选用LY294002浓度为20μmol/L作为与DDP联合的干预浓度。见表1。
由表1可以看出：DDP单用时，浓度达1μg/ml可显示抑制A549细胞的增殖，抑制率为11.41％，各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；随着浓度的增大，抑制作用增大，呈剂量效应关系（r＝0.808，P＜0.05）。LY294002与DDP联用时，DDP浓度为0.5μg/ml即可显示出抑制A549细胞的增殖，抑制率为9.65％。各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。LY294002+DDP各浓度组与DDP单独作用对应各浓度组相比，DDP浓度为0.5μg/ml和1μg/ml时，抑制率的差异有统计学意义（P＜0.05）。当DDP浓度再增加，各药物联合组抑制率与DDP单用组相比，有增高的趋势，但其差异无统计学意义（P＞0.05)。低浓度组，药物联合组抑制率与DDP单用组相比，差别较大，DDP浓度越高，其差别越小。
2.2LY294002与DDP联用对A549细胞周期及凋亡率的影响DDP、LY294002及LY294002与DDP联用干预A549细胞后，各药物组凋亡率与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）；DDP＋LY294002组与DDP组及LY294002组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。细胞周期分布与对照组相比都发生变化，表现为S期和G2/M期细胞减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。LY294002+DDP组细胞与DDP或LY294002单独作用于A549细胞相比，S期和G2/M期细胞减少（P＜0.05）。见表2。
2.3LY294002联合DDP对裸鼠移植瘤生长的影响裸鼠皮下接种A549细胞后，约1w左右见皮下移植瘤出现，呈圆形或椭圆形结节。在实验过程中，各组裸鼠均未出现精神、进食、排便的明显异常及死亡。各组间裸鼠体重无明显差异（P＞0.05）。LY294002、DDP组、DDP+LY294002组瘤结节重量均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。DDP+LY294002组瘤结节重量又低于LY294002、DDP组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。LY294002、DDP组、DDP+LY294002组的抑瘤率分别为40.3％、43.53％和67.46％，提示LY294002与DDP均能抑制裸鼠移植瘤的生长，两者联合应用抑瘤作用强于单独应用。见表3。
表1LY294002与DDP联用对A549细胞生长的抑制效应（略）
与对照组相比：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与DDP单用组相比：3）P＜0.05
表2LY294002联合DDP或紫杉醇对A549细胞周期的影响（略）
与对照组相比：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与DDP组相比：3）P＜0.05；与LY294002组相比：4）P＜0.05
表3LY294002联合DDP对裸鼠移植瘤生长的抑制效应（略）
与对照组相比：1）P＜0.01；与LY294002组相比：2）P＜0.01；DDP组相比：3）P＜0.01
3讨论
非小细胞肺癌（NSCLC）约75％的肺癌患者在发现时已属晚期〔3〕，放、化疗对各期病人均为重要的治疗方法。而单纯采用化疗或放疗效果并不令人满意。研究证实DDP等化疗药物除直接杀伤肿瘤细胞外，还可诱导肿瘤细胞进入凋亡程序，由此推论，凋亡是耐药产生的共同途径〔4〕，细胞凋亡能力可直接影响化疗药物的效应〔5〕。肿瘤细胞可通过抑制进入凋亡程序，表现出对化疗药物的耐受性，是肿瘤细胞所具有的自我保护功能之一。选择性诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的一条途径，有可能改善患者的预后〔6〕。P13K信号转导通路具有调节细胞的增殖、生存和分化等功能，PI3K可上调抗凋亡基因的表达，抑制由cmyc诱导的细胞凋亡〔7〕，以抑制细胞进入凋亡程序，促进细胞生存，因此推测P13K信号转导通路可能在多细胞耐药中发挥作用。最近肿瘤分子靶向治疗研究发现信号转导途径与肿瘤进展和放、化疗抵抗有密切的关系。PI3K/Akt抑制剂在体外可抑制多种肿瘤细胞的生长，导致肿瘤细胞凋亡〔8，9〕。近年的研究还发现PI3K/Akt抑制剂LY294002可增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗〔2，10〕。
本研究显示，DDP及LY294002对A549细胞的增殖有显著抑制作用，二者联用与单独干预相比对A549细胞增殖的抑制作用增强，说明LY294002有增加化疗药物治疗效果的趋势。DDP与LY294002均可影响细胞周期的分布，使细胞阻滞于G0/G1期，二者联用后，该作用增强。裸鼠移植瘤体内实验结果表明LY294002、DDP均能抑制裸鼠移植瘤的生长，LY294002与DDP联用时抑瘤率增加，说明LY294002能促进DDP的抑瘤效应。以上作用可能是通过以下3方面来实现的：①LY294002使细胞周期阻滞G0/G1期，抑制细胞的增殖；②LY294002促进细胞的凋亡；③有研究发现〔11〕若将P13K亚单位基因引入体外细胞系中，可使PI3K/Akt信号转导通路活性增强，细胞对化疗药物的敏感性会随之降低，耐药性增强。说明LY294002也可能通过增强对信号转导通路的调控增强肿瘤细胞对DDP的敏感性，从而使DDP的化疗效果增强。本研究过程中各组裸鼠均未出现精神、进食、排便的明显异常及死亡。实验结束后各处理组裸鼠体重亦无显著差异，解剖未见远处及局部淋巴结转移，各组肝、胃及肠道等重要脏器的HE染色未发现明显差异，说明LY294002在体内应用相对来说是安全的。但LY294002对人体是否有毒副作用及增加化疗药物的抗癌效果，由于细胞内及动物脏器的生理特点与人类有差别，还需要进一步的研究去证实。
本研究认为，LY294002可促进Akt高表达肿瘤的抗肿瘤药物的疗效，而对于Akt低表达的肿瘤化疗效果无影响，其促进化疗疗效的作用主要是通过促进细胞凋亡实现的。而Howells等〔12〕在应用LY294002作用于乳腺癌细胞时，却发现其抑制癌细胞增殖与导致细胞凋亡并无直接关系。因此，LY294002本身抗肿瘤及与化疗的协同作用具体机制还不清楚，还存在许多悬而未决的问题，仍需进一步的更加精确的研究证实。
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【摘要】目的:构建人IL8正义和反义真核表达载体。方法:RTPCR扩增正义和反义IL8基因片段后，将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)，通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定后，采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞中，并用RTPCR和ELISA法检测细胞转染后IL8的表达水平。结果:经验证，重组人IL8正义/反义真核表达载体构建正确。pcDNA3.1(+)ssIL8转染A2780细胞后，其IL8mRNA及蛋白表达水平均显著增加;而pcDNA3.1(+)asIL8转染SKOV3细胞后，其IL8分泌水平降低。结论:成功构建了人IL8正义/反义真核表达质粒pcDNA3.1(+)ssIL8/pcDNA3.1(+)asIL8，为后续研究IL8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础。
【关键词】IL8;正义/反义;真核表达载体;卵巢癌细胞
[Abstract]AIM:ToconstructthesenseorantisenseIL8eukaryoticexpressionvectors.METHODS:SenseorantisenseIL8fulllengthgenewereamplifiedbyRTPCRandclonedintoeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+).AftertheidentificationbyPCR，restrictionendonucleasedigestionandthenucleotidesequencing，therecombinantvectorsweretransfectedintohumanovariancarcinomaA2780andSKOV3celllinestransientlybylipofectaminemediation.TheexpressionofIL8geneandproteinweredetectedbyRTPCRandELISA.RESULTS:ThesenseorantisenseIL8eukaryoticexpressionvectorswereconstructedandverified.TheexpressionofIL8geneandproteininA2780cellstransfectedwithpcDNA3.1(+)ssIL8wereincreased，whereastheexpressionofIL8proteininSKOV3cellstransfectedwithpcDNA3.1(+)asIL8wasdecreased.CONCLUSION:TheeukaryoticexpressionvectorspcDNA3.1(+)ssIL8orpcDNA3.1(+)asIL8havebeenconstructedsuccessfully，whichlaysabaseforfurtherstudyonrolesofIL8inovariancancerandothertumors.
[Keywords]IL8;senseorantisense;eukaryoticexpressionvector;ovariancarcinomacells
IL8是一种多功能的趋化因子，可参与多种恶性肿瘤的生长、转移及血管生成。近年来研究表明[1，2]，IL8在卵巢癌中高表达，其高表达可能与卵巢癌发生、发展及化疗关系密切。我们前期研究发现[3，4]，IL8及雌、雄激素均可促进卵巢癌细胞增殖;IL8还可在无雌、雄激素的条件下调节卵巢癌细胞表达雌、雄激素的受体，从而增加该细胞对两种激素的敏感性。为了深入探讨IL8在卵巢癌发生、发展及化疗和内分泌治疗中的作用及作用机制，我们应用基因重组技术，成功构建人IL8正义(sense，ss)和反义(antisense，as)真核表达载体，从而为后续研究IL8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用及作用机制奠定基础。
1材料和方法
1.1材料TOP10感受态细菌购自北京天根生物公司;真核表达载体pcDNA3.1(+)为美国Invitrogen公司产品，由本室保存。人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞均为美国ATCC公司产品，由本室保存。RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品;2×PremixTaq、MMLV逆转录酶、BamHⅠ、XhoⅠ为TaKaRa公司产品;T4DNA连接酶为美国NEB公司产品、DNA胶回收试剂盒为加拿大BioBasic公司产品;人IL8ELISA试剂盒为美国R&D公司产品;OptiMEMⅠ、LipofectamineTM2000、TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品;100bp和1kbDNAMarker、高纯度质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司。
1.2方法
1.2.1引物设计人IL8全长编码基因扩增用引物，参照GenBank数据库(NM000584.2)，采用DNAMAN软件设计，senseIL8引物，F:5′CTCGGATCCATGACTTCCAAGCTGGCCGTG3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点)，R:5′AGACTCGAGTTATGAATTCTCAGCCCTCTT3′(划线部分为XhoⅠ酶切位点);目的片段318bp。antisenseIL8引物，F:5′CTCGGATCCATGTGAATTCTCAGCCCTCTT3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点)，R:5′AGACTCGAGTTAACTTCCAAGCTGGCCGTG3′(划线部分为XhoⅠ酶切位点)，目的片段318bp。
1.2.2目的基因的扩增自SKOV3细胞中提取总RNA作为逆转录模板，采用RTPCR方法扩增IL8正义全长目的基因片段。逆转录反应条件参照TaKaRaMMLV逆转录酶说明书进行，逆转录产生的cDNA经PCR扩增获得约300bp大小的目的片段(引物序列见1.2.1)。50μLIL8正义PCR产物经12g/L琼脂糖凝胶电泳后，按照DNA胶回收试剂盒说明回收纯化DNA片段。以此纯化的IL8正义PCR产物为模板，扩增IL8反义全长目的基因片段(引物序列见1.2.1)。PCR反应体系:cDNA0.5μL，2×PremixTaq25μL，上、下游引物各25pmol，加双蒸水至总体积50μL。PCR反应条件:94℃5min预变性;94℃30s变性，59℃45s退火，72℃1min延伸，34个循环;72℃延伸10min。
1.2.3重组质粒的构建空载体pcDNA3.1(+)、IL8正义或反义PCR纯化回收产物分别用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，经电泳回收目的条带后定量。按照目的片段和载体片段摩尔比为3∶1的原则，用T4DNA连接酶将双酶切后的目的片段和空载体进行连接，而后转化入TOP10感受态细菌。将转化细菌均匀涂布于含氨苄青霉素50mg/L的LB琼脂平板上，倒置于37℃温箱培养12h(过夜)。
1.2.4重组质粒的鉴定挑取孤立菌落，用100μL去离子水重悬，作为模板，进行菌落PCR扩增鉴定。PCR反应体系为:菌落1μL，2×PremixTaq10μL，上、下游引物各10pmol(引物序列见1.2.1)，加双蒸水至总体积20μL。PCR反应条件同1.2.2。经菌落PCR鉴定阳性的单菌落，接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB液体培养基中，37℃恒温摇床震荡培养过夜，按照质粒小量提取试剂盒说明提取质粒，并用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定。经菌落PCR和酶切鉴定证实有插入片段后，将阳性菌液2mL送北京天根生物公司测序，将测序结果正确的重组载体分别命名为pcDNA3.1(+)ssIL8和pcDNA3.1(+)asIL8。
1.2.5细胞瞬时转染采用脂质体法将重组载体pcDNA3.1(+)ssIL8或pcDNA3.1(+)asIL8及空载体pcDNA3.1(+)分别导入A2780细胞和SKOV3细胞中。按照脂质体LipofectamineTM2000说明书进行，具体步骤如下:用无抗生素、含100mL/LFBS的RPMI1640培养液调整细胞密度为2×108/L，每孔2mL加入6孔板，37℃、50mL/LCO2培养过夜。待细胞生长至80%融合时，更换新鲜的无抗生素、含100mL/LFBS的RPMI1640培养液。准备A、B两液，A液:250μLOptiMEMⅠ，加入4μg重组载体或空载体，轻混;B液:250μLOptiMEMⅠ，加入10μL脂质体，轻混后室温放置5min。上述两液混合后，室温放置20min，加入到每孔细胞中，37℃、50mL/LCO2培养6h后，更换无抗生素、含100mL/LFBS的RPMI1640培养液，每孔2mL。转染细胞分别命名为pcDNA3.1(+)/A2780、pcDNA3.1(+)ssIL8/A2780和pcDNA3.1(+)/SKOV3、pcDNA3.1(+)asIL8/SKOV3。
1.2.6细胞转染后IL8表达水平的检测转染后24h，采用ELISA法检测上清中IL8的含量;同时收集细胞，抽提RNA后分别以IL8的特异性引物进行RTPCR反应。引物序列如下:IL8，F:5′AACATGACTTCCAAGCTGGCCG3′，R:5′CAGTTTTCCTTGGGGTCCAGAC3′，目的片段251bp;内参照GAPDH，F:5′CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA3′，R:5′ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA3′，目的片段450bp。PCR反应体系:cDNA1.0μL，2×PremixTaq10μL，上、下游引物各10pmol，加双蒸水至总体积20μL。PCR反应条件:94℃5min预变性;94℃30s变性，59℃45s退火，72℃1min延伸，34个循环;72℃延伸10min。反应结束后，取PCR反应液5μL于12g/L琼脂糖凝胶电泳。
2结果
2.1正义和反义IL8全长基因片段扩增以SKOV3细胞的总RNA为模板，应用前述引物进行RTPCR，将扩增产物进行12g/L琼脂糖凝胶电泳(图1)，可见300bp左右单一条带，与预计片段长度(318bp)相符。
2.2重组载体的构建与鉴定目的片段和空载体分别经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，按照目的片段与空载体的摩尔比为3∶1进行连接反应，连接产物进行转化并过夜培养，次日可见阳性菌落形成。挑选独立阳性菌落进行PCR扩增后，可见约300bp的条带(图2)。挑取PCR鉴定阳性的菌落摇菌，提取质粒DNA后进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定(图3)，可见约5.3kb和300bp左右的片段出现，说明真核表达载体pcDNA3.1(+)上已成功插入了ssIL8或asIL8全长编码基因。对阳性克隆中的插入片段进行序列测定，结果显示，所克隆的基因与GenBank数据库中人IL8的正义及反义全长序列完全一致。
2.3RTPCR技术检测IL8mRNA在A2780细胞中的表达与对照A2780细胞和pcDNA3.1(+)/A2780细胞相比(图4)，pcDNA3.1(+)ssIL8/A2780细胞的IL8mRNA的表达水平明显增高，而未转染细胞和转染空载体细胞之间差别不大。
2.4ELISA法检测IL8蛋白在A2780和SKOV3细胞中的表达转染正义IL8的pcDNA3.1(+)ssIL8/A2780细胞的IL8蛋白表达水平为(1.043±0.004)μg/L，明显高于转染空载体的pcDNA3.1(+)/A2780细胞(0.010±0.001)μg/L(P
3讨论
IL8是一种多功能的趋化性细胞因子，有学者认为IL8具有激活嗜中性粒细胞聚集到肿瘤局部，对肿瘤细胞起杀伤和抑制作用;而多数学者认为，IL8能促进肿瘤的生长和转移，其机制主要是通过作为自分泌生长因子、血管发生因子和促进Ⅳ型胶原酶的活性以及影响细胞的黏附移动，从而促进肿瘤的发生、发展和转移。IL8在多数肿瘤组织中高表达，而在其相应的正常组织却不表达或低表达[5]。研究表明，卵巢癌患者高表达IL8，其腹水中表达水平明显高于血清[1]。应用免疫组化技术发现，卵巢癌患者局部肿瘤组织中的IL8高表达与肿瘤的进展程度及不良预后有关[2]。从卵巢癌细胞系HeyA8分离出的IL8高分泌克隆HeyA8(H)的增殖率明显高于低分泌克隆HeyA8(L)，IL8可促进HeyA8(L)克隆的增殖，而IL8的中和抗体可降低HeyA8(H)克隆的增殖;应用IL8表达载体转染的HeyA8(L)克隆以增强IL8的表达后，可明显促进肿瘤细胞的增殖、微血管密度以及后来的肿瘤形成[6]。IL8还可封闭TNF相关凋亡诱导配体(TNFrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL)诱导的细胞死亡，并且能使TRAIL敏感的细胞系转变为TRAIL抗性细胞系，表明IL8在保护卵巢癌细胞逃避TRAIL介导的凋亡中起重要作用[7]。此外，IL8表达可影响卵巢癌对化疗的敏感性。应用基因芯片技术分析发现，紫杉醇耐药卵巢癌细胞的IL8mRNA及蛋白表达均增加。Penson等报道[1]，卵巢癌患者在紫杉醇治疗前给予甾体类抗雌激素治疗则血清中IL8水平下降，紫杉醇治疗后24h则其水平上升。这一结果与早期Lee等人体外研究发现的紫杉醇可诱导人卵巢癌细胞的IL8转录和分泌的结果相一致。目前有关IL8诱导卵巢癌细胞对化疗药物产生耐药的机制尚不十分清楚。
我们以往的研究证明人卵巢癌细胞系SKOV3可组成性高表达IL8[5，8]，而本研究证实，另一种人卵巢癌细胞系A2780中的IL8表达水平极低。提示这两种卵巢癌细胞可作为研究IL8在卵巢癌中作用及作用机制的一个良好模型。本研究首先从高表达IL8的SKOV3细胞中提取总RNA并以此为模板，根据人IL8的全长编码区基因序列设计并合成ssIL8和asIL8两对引物，通过RTPCR获得318bp大小的目的片段即正义和反义IL8全长编码基因，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，由此构建了重组载体pcDNA3.1(+)ssIL8和pcDNA3.1(+)asIL8，后经菌落PCR、双酶切及核苷酸测序，证实所获片段和目的片段序列完全一致。最后应用脂质体法将IL8正义和反义表达载体分别导入低表达IL8的A2780细胞和高表达IL8的SKOV3细胞中，并用RTPCR和ELISA法检测细胞转染后IL8的表达水平，发现IL8的表达量具有明显差异，从而达到了预期的试验目的。总之，人IL8正义和反义真核表达载体的成功构建，将为我们后续研究IL8在卵巢癌发展及化疗、内分泌治疗中的作用与作用机制奠定基础，同时也为研究其他高表达IL8的恶性肿瘤提供参考。
参考文献
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摘要为了分析针灸对抗化疗药物所致骨髓抑制,用环磷酰胺(CY)建造小鼠骨髓抑制模型,随机分为CY加艾灸组、CY对照组、CY加针刺组,并与正常小鼠对照。每隔48小时检测股骨髓有核细胞总数、骨髓细胞分类计数。结果显示:灸、刺可加快造血细胞分裂增殖,促进白细胞向外周血释放,尤其对粒系作用明显。
主题词骨髓/针灸效应骨髓细胞/针灸效应粒细胞/针灸效应
针灸能够升高化疗药物环磷酰胺(CY)所致小鼠外周血降低的白细胞。笔者曾观察了白细胞的动态变化并做了报道[1]。为了进一步阐明针灸升高白细胞的机制,我们观察了针灸对CY化疗小鼠骨髓造血细胞及粒系细胞动态变化的过程,现报告如下。
1材料及方法
1.1实验动物及化疗药物
健康雄性昆明种小鼠,7周龄,体重20～30g(河南医科大学实验动物中心提供)。CY(上海第十二制药厂产品)。
1.3动物分组及造模
64只小鼠随机分为4组:A组19只为CY加艾灸治疗组(艾灸组);B组19只为CY对照组(对照组);C组19只为CY加针刺治疗组(针刺组);D组7只为正常对照组(正常组)。A、B、C组小鼠按200mg/kg腹腔一次性注射CY,CY用生理盐水配制成10mg/ml;D组则腹腔注射同体积生理盐水。
1.4针灸治疗
各组小鼠于腹腔注射后立即开始针灸治疗或对照处理,每日1次,连续6天,各组配对同时进行。将A组小鼠伏卧固定于木板上,在"大椎"、"膈俞"穴(模拟大鼠穴位定位法[2])上涂医用凡士林少许,制小艾炷(稍大于绿豆,重约1.5mg),直接放在"大椎"、"膈俞"穴上,用线香点燃,待艾炷燃至小鼠挣扎时,即用镊子夹去,每穴4壮。同法固定C组小鼠,取双侧"足三里"、"三阴交"穴,用直径为0.22mm,长13mm毫针,刺入3mm左右,留针5min。B、D组小鼠仅陪同固定,不治疗。
1.5检测
从对小鼠注射时算起的第3,5天,A、B、C组各颈椎脱位处死6只,第7天将4组全部脱颈处死,查股骨髓有核细胞总数,骨髓细胞分类计数,方法参照文献[3]。
2结果
2.1骨髓有核细胞
各组小鼠骨髓有核细胞数见表1。
从表1可见,小鼠用CY后的第3天,各组间股骨髓有核细胞总数差异无统计学意义,但较正常动物明显减少(正常组第7天数据作为正常对照指标,后同)。第5天,有核细胞呈现A>C>B,差异有统计学意义,说明针灸刺激了造血细胞增殖,艾灸效果最好。第7天,A、B、C组骨髓有核细胞又较第5天明显增加,灸、刺组仍优于对照组,但数量少于正常组。
2.2骨髓细胞分类
各组小鼠骨髓细胞分类计数见表2(仅列出粒系)。
3讨论
小鼠注CY的第3天,各组有核细胞总数相近,但粒系百分数合计呈现B>C>A,差异具有显著统计学意义。进一步观察可见成熟池(晚幼、杆状、分叶)细胞所占百分比均呈现B>C>A,似可说明,在骨髓有核细胞相近的前提下,灸、刺使成熟池百分比减少,是由于向外周血中释放的原故,实际上第3天灸、刺已经显示出了促进造血细胞增殖的效果。
小鼠注CY的第5天,粒系百分数合计由第3天的B>C>A而变为A>C>B,尽管〖WTBX〗P>0.05,由于①对比发生逆转,②骨髓有核细胞总数此时呈现A>C>B,所以具有医学意义,进一步说明艾灸和针刺加速了骨髓粒细胞的分裂增殖和成熟。另外从造血细胞分裂增殖的时相分析:由于第3天灸、刺组骨髓成熟池细胞百分比少于对照组,反馈性调节增殖池(原始、早幼、中幼)细胞加速分裂成熟,相隔48h的第5天,这个效应通过中幼百分比印证,呈现A>C>B,并且A>B有极显著统计学意义。相隔早幼时相,原始粒细胞的百分比呈现B>C>A,这可能是处理方法造成的假象,如将各组原始粒细胞参照表1换算为绝对数:艾灸组=1246.7万×17.5%=218万;针刺组=816.7万×26.8%=219万;对照组=616.7万×28.0%=173万。结果仍是刺、灸组多。
小鼠注CY的第7天,粒系百分数合计A>C>B,A>B差异有显著统计学意义,C>B差异不显著。由于骨髓有核细胞针刺组同样高于对照组,参照表1换算成绝对数,仍具有医学意义。第7天,3组注CY小鼠各类粒细胞百分比均高于正常组(有类白血病反应,此处不讨论),提示小鼠注CY后,粒系细胞立即被杀灭,百分比减少,以后迅速的反馈性调节,使粒系增高并超越正常小鼠。借助文献[1]数据,当外周血白细胞低于正常水平时,艾灸和针刺加强这种负反馈,可使外周血白细胞较快的回升。当第7天外周血白细胞已接近或超越正常水平时,从骨髓粒系增殖池和成熟池的百分比分析,艾灸和针刺仍起到较好的负反馈调节作用,使增殖池百分比低于对照组,从而抑制外周血白细胞过高的反跳,因此说明,针灸还可治疗外周血白细胞增高症。从我们的预实验看到[4],单纯造模,可使外周血白细胞的反跳(高于正常小鼠)持续相当长一段时间。第7天的数据提示,灸刺可减轻反跳。
4结论
临床上用针灸治疗化疗所致白细胞减少症,通过本实验可以证明3点作用机制:第1,灸、刺提高骨髓有核细胞的绝对数,并在第5天开始提高中性粒系的相对数,即是促进了骨髓造血细胞的分裂增殖,尤其对粒系作用明显。第2,在骨髓有核细胞绝对数相近的条件下,灸、刺组成熟池细胞百分比下降,似说明是灸、刺促使其向外周血中释放所致。第3,提示灸、刺可以调整白细胞生成过程中负反馈调节的力度,从而可防止因化疗药物所致白细胞过高的反跳,推测灸、刺还有可能治疗白细胞增多症。
5参考文献
1赵喜新.针灸对化疗小鼠白细胞动态变化的影响.河南中医,1996;16(4):216
2华兴邦,等.大鼠穴位图谱的研制.实验动物与动物实验,1991;(1):2
3施新猷,等.医学动物实验方法.北京:人民卫生出版社,1980:279
【关键词】Kruppel－likefactor8;多药耐药;胃癌;缺氧
缺氧是肿瘤组织中重要的微环境，在实体瘤中普遍存在，随着瘤体的不断增长及肿瘤组织中血管的畸形生长，必然会导致肿瘤组织中氧分压下降，形成区别于正常组织的缺氧环境［1－3］。我们前期研究结果发现缺氧能够加剧胃癌细胞的多药耐药的发生，但机制尚不清楚［4－6］。本实验室的胃癌细胞系分别经常氧和缺氧培养发现，缺氧后胃癌细胞中KLF8的表达量明显升高，同时也发现KLF8在胃癌耐药细胞系中呈高表达状态，提示KLF8可能参与了缺氧条件下胃癌细胞多药耐药现象的发生。为此本实验以胃癌细胞为研究对象，探讨缺氧条件下KLF8参与胃癌细胞多药耐药的机制，旨在更加全面了解缺氧诱导胃癌细胞发生多药耐药的机制。
1材料和方法
1．1材料
人胃癌细胞系SGC7901引自军事医学科学院，人胃癌细胞系MKN45和MKN28引自中科院上海细胞库由本实验室保存;人胃癌长春新碱耐药细胞系SGC7901/VCR由西京医院消化内科实验室惠赠。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液常规培养人胃癌细胞SGC7901、MKN28、MKN45及耐药细胞SGC7901/VCR。待细胞密度达70%后，将细胞分别置于常规培养孵箱(37℃，5%CO2)及缺氧孵箱(37℃，5%CO2，1%O2，94%N2)中继续培养。其中SGC7901/VCR培养液中需加入1μg/ml的长春新碱(VCR)作为其维持浓度。
1．2方法
1．2．1RNA
提取和实时定量聚合酶链反应(RT－PCR)利用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取培养细胞或组织中的总RNA。用PrimeScriptRT试剂盒(TaKaRa，Dalian，China)合成cDNA。用SYBRPremixExTaqII(TaKa-Ra)进行聚合酶链反应并用Bio－RadCFX96TMManager(Bio－Rad，Hercules，USA)进行检测。基因引物购自TaKaRa(Dalian，China)。KLF8的RT－PCR引物为(正义链):5＇－TCTGCAGGGACTACAGCAAG－3＇以及(反义链):5＇－TCA-CATTGGTGAATCCGTCT－3＇。GAPDH引物为(正义链):5＇－TGACTTCAACAGCGACACCCA－3＇以及(反义链):5＇－CAC-CCTGTTGCTGTAGCCAAA－3＇。PCR的条件为:95℃5秒，55℃30秒和72℃30秒，45个循环。GAPDH被用做内对照。所有的RT－PCR反应均重复三次。用2－ΔΔCt进行基因定量水平的检测。KLF8表达的结果用lg(2－ΔΔCt)表示。
1．2．2蛋白提取和Westernblot
待各种胃癌细胞密度生长达90%后，分别用1ml冰的PBS清洗细胞两次，随后再加入1mlPBS，用细胞刮将细胞刮下，移液器将细胞悬液移入1．5ml离心管中，1000×g，4℃离心5min;用吸引器小心地吸出上清，加入100μl细胞裂解液，用超声探头进行超声使其充分裂解，每种细胞超声3次，每次7～10s，间隔1～2min;超声后，冰上静置15～20min，随后放置4℃离心机中，12000r/min，离心15min;吸取上清为各胃癌细胞总蛋白质，蛋白定量，加入5×LoadingBuffer后－20℃冻存备用。配制SDS－PAGE凝胶，取适量的蛋白样品给每孔道进行上样;电泳:恒流20mA，60min;裁剪合适大小的NC膜及滤纸，将裁好的NC膜浸泡在转膜缓冲液中10min，备用;转膜:由下至上放置的顺序为:滤纸、NC膜、凝胶、滤纸。恒压条件下转膜，20V，30min;用TBST配制含5%牛奶的封闭液，室温封闭1h;用含2%牛奶的TBST稀释一抗，4℃封闭过夜;选择合适的二抗，用TBST稀释后，室温下封闭1h;用ECL显色液进行显影。
1．2．3构建正义表达载体和小干扰
RNA慢病毒制备和转染KLF－8siRNA干扰序列的设计和合成以及载体构建由上海吉凯公司完成。序列如下:KLF8－siRNA1:5＇－ACUUG-GAGGUCCAACUUAATT－3＇，5＇－UUAAGUUACCUCCAAGGTG－3＇;KLF8－siRNA2:5＇－CGAUAUGGAUAACUCAUATT－3＇，5＇－UAUGAGUUUAUCCAUAUCGAC－3＇;KLF8－siRNA3:5＇－CACUGGUUAAUGACAUCAATT－3＇，5＇－UUGAUGUCAU-UAAACAGUGCTA－3＇;scrambledsiRNA(阴性对照)5＇－UU-CUCCGAACGUGUCACGUTT－3＇，5＇－ACGUGACACGUUCG-GAGAATT－3＇。检测敲除的效力后，合成了编码发夹的寡核苷酸，克隆至慢病毒载体PsicoR(Addgene)。非靶发夹DNAPsicoR载体作为阴性对照。在第7天用KLF8siRNA－慢病毒或阴性对照病毒转染SHC7901细胞，至第10天检测转染效力。将KLF8的过表达，小干扰RNA及空载体病毒转染入SGC7901细胞中，转染后细胞分别为SGC7901－KLF8、SGC7901－siKLF8、SGC7901－NC;将KLF8的小干扰RNA及空载体病毒转染入SGC7901/VCR细胞中，转染后细胞分别为SGC7901/VCR－siKLF8、SGC7901/VCR－NC。
1．2．4体外药物敏感性试验
用胰酶常规消化胃癌细胞，800r/min离心5min，收集细胞沉淀;用正常培养液重悬，制成单细胞悬液，细胞计数;用移液器吸取200μl稀释后的单细胞悬液，加入96孔板的每孔中，并使每孔的细胞数达5×103个，放入孵箱常规培养;待细胞贴壁后，将细胞分别放入常氧及缺氧孵箱继续培养24h;将四种化疗药物按不同浓度，一定顺序加入每孔细胞中，随后继续常氧及缺氧培养48h，每孔细胞培养液中加入20μlMTT溶液，37℃孵育4h，用一次性针头小心吸弃孔内上清;每孔加入150μlDMSO，震荡器上震荡10min，使结晶充分溶解;在酶联免疫仪上选择490nm波长测定吸光度值，计算5孔的平均值(X值)。根据存活率的公式，计算不同化疗药物不同浓度时胃癌细胞的存活率;细胞存活率=(实验组X值－空白对照组X值)/(阴性对照组X值－空白对照组X值)×100%;细胞死亡率=1－细胞存活率;IC50:将不同化疗药物的浓度及对应的细胞死亡率分别输入IC50统计软件中，计算得出胃癌细胞对不同化疗药物的IC50值。
1．2．5流式细胞仪检测细胞凋亡
转染48小时后收集各组细胞，PBS缓冲液洗涤，胰酶消化，调整细胞密度至1×106/ml，取100μl细胞悬液于5ml流式管，加入5μlAnnexinV－FITC和10μl碘化丙啶(PI)溶液，轻轻混匀，室温避光染色15分钟。在反应管中加入400μlPBS，立即行流式细胞仪检测，以对照细胞为对照组。每个样本重复3次。
1．2．6细胞内阿霉素蓄积和潴留的检测
待胃癌细胞达对数生长期后用胰酶消化细胞并移入离心管中，800r/min离心5min，收集细胞沉淀;随后将细胞接种于6孔板中，使每孔细胞密度达70%，将细胞分别放置常氧及缺氧孵箱中继续常氧或缺氧培养24h，取出细胞，阴性对照孔常规细胞换液，ADR蓄积孔及潴留孔中分别加入ADR，使终浓度达到5mg/L，继续常氧或缺氧培养1．5h，流式细胞仪检测，激发波长为488nm，接受波长575nm，细胞中可出现红色标记物即为ADR，可计算出细胞中ADR的蓄积量及潴留量，根据公式可得出药物的泵出率，药物泵出率=(细胞中阿霉素蓄积量－细胞中阿霉素潴留量)/细胞中阿霉素蓄积量×100%。
1．3统计学方法
采用SPSS18．0软件包进行统计分析，计量资料数据用均数±标准差表示，计量资料的比较采用Kruskal－WallisH检验，两组间差异比较用Mann－WhitneyU检验;计数资料比较采用卡方检验，Westernblot灰度值、生长曲线、细胞凋亡采用t检验。P＜0．05时对比组之间的差异具有统计学意义。两组间相关性采用Spearman相关分析。
2结果
2．1缺氧条件下KLF8的mRNA水平和蛋白表达
将MKN45细胞、MKN28细胞及SGC7901细胞分别经常氧及缺氧处理后，利用定量PCR和Westernbolt方法检测胃癌细胞中的mRNA水平和蛋白表达的变化，结果显示，与常氧条件下相比，三株胃癌细胞系在缺氧培养后KLF8的mR-NA表达水平和蛋白表达均有所上升，MKN45和SGC7901细胞经缺氧处理后KLF8的mRNA水平和蛋白表达呈时间依赖性升高。MKN28细胞在缺氧4小时后KLF8的mRNA水平和蛋白表达显著升高(图1)。以上结果显示，缺氧显著增加了不同胃癌细胞系中KLF8的mRNA表达水平。
2．2胃癌耐药细胞系中KLF8的表达水平
分别提取SGC7901细胞、SGC7901/VCR细胞及SGC7901/ADR细胞三种细胞的RNA和蛋白，利用PCR和Westernblot方法检测KLF8在三种细胞中的mRNA水平和蛋白表达。结果显示，和SGC7901细胞相比，KLF8的mRNA水平和蛋白表达在SGC7901/VCR细胞及SGC7901/ADR细胞中均显著增高，且在SGC7901/VCR细胞中表达升高的更为明显(P＜0．01)。
2．3构建KLF8过表达和siRNA载体及其在转染细胞中的表达
实时定量PCR方法和Westernblot检测各转染细胞中KLF8的表达量。结果显示:稳定转染KLF8的正义表达载体后，SGC7901细胞中KLF8的表达量明显升高，稳定转染KLF8－siRNA载体后，耐药细胞SGC7901/VCR细胞及缺氧条件下SGC7901－siKLF8细胞中的KLF8表达量均显著降低。以上结果说明，构建的载体均可有效地促进或抑制KLF8的表达，稳定转染的细胞系均可用于后续实验。
2．4KLF8参与缺氧诱导胃癌细胞多药耐药的表型研究
2．4．1KLF8影响胃癌细胞对化疗药物的敏感性
体外药敏实验(MTT法)结果显示，常氧条件下，与SGC7901细胞及SGC7901－NC细胞相比，SGC7901－KLF8细胞对四种化疗药物的敏感性均降低;随后观察了耐药细胞对化疗药物敏感性，发现SGC7901/VCR－siKLF8细胞对化疗药物的敏感性均较SGC7901/VCR细胞和SGC7901/VCR－NC细胞对化疗药物的敏感性有显著增加(表1)。缺氧条件下，SGC7901－siKLF8细胞和SGC7901/VCR－siKLF8细胞对四种化疗药物的敏感性均有所增加(表2)。以上结果提示，KLF8过表达可增加胃癌细胞对化疗药物的耐受性，促进了多药耐药现象的发生，干扰KLF8表达后可有效抑制缺氧诱导的多药耐药现象的发生。
2．4．2KLF8影响胃癌细胞的凋亡
通过流式细胞仪检测常氧组细胞及缺氧组细胞在VCR诱导下的细胞凋亡指数。结果显示，常氧条件下，用VCR诱导常氧组细胞后，发现与SGC7901细胞、SGC7901－NC细胞相比，SGC7901－KLF8可明显抵抗VCR诱导的细胞凋亡，其凋亡指数显著下降，具有统计学意义(P＜0．05);而未经VCR诱导的常氧组细胞，其细胞很少发生凋亡，凋亡指数均较低且无统计学差异(P＞0．05)(图4左)。缺氧条件下，抑制KLF8表达后，SGC7901－siKLF8细胞对VCR诱导的细胞凋亡指数较SGC7901细胞及SGC7901－NC细胞的凋亡指数明显升高，具有统计学意义(P＜0．05);未经VCR诱导的缺氧组细胞，其凋亡指数无差异(P＞0．05)。以上结果提示，KLF8过表达可增强胃癌细胞的抗凋亡能力从而介导胃癌细胞多药耐药的表型，抑制KLF8的表达可逆转缺氧诱导的胃癌细胞多药耐药的表型。
2．4．3KLF8影响胃癌细胞中阿霉素的泵出率
用流式细胞仪检测ADR在常氧组及缺氧组细胞中的潴留量与蓄积量，根据公式计算药物泵出率。结果显示，常氧条件下，与SGC7901细胞和SGC7901－NC细胞相比，SGC7901－KLF8细胞中化疗药物阿霉素的泵出率显著增加，且具有统计学意义(P＜0．05);缺氧条件下，抑制KLF8的表达后，SGC7901－siKLF8细胞中化疗药物阿霉素的泵出率明显减少。以上结果提示，KLF8可通过提高胃癌细胞对化疗药物的泵出率从而介导胃癌细胞多药耐药现象的发生，抑制KLF8表达后此现象可被逆转。
3讨论
胃癌是我国最常见的消化道肿瘤，在我国超过半数以上的胃癌病例在发现时已处于晚期，肿瘤的转移和复发是导致患者死亡的最主要原因［7－8］。众多研究发现，在实体瘤中，缺氧这一重要现象普遍存在，随着瘤体的不断增长，其肿瘤中心的缺氧程度也逐渐加重。缺氧已被证实为肿瘤中重要的微环境，它可导致肿瘤细胞产生多药耐药的现象，成为肿瘤复发和疗效差的主要原因［4，9－10］。我们以往的研究发现缺氧能够诱导胃癌多药耐药的发生［6，11－12］。但是缺氧诱导胃癌多药耐药的机制仍待进一步研究;本研究发现缺氧能够诱导转录因子KLF8的表达，进一步的研究发现在胃癌耐药细胞中KLF8的mRNA及蛋白水平均显著上调，提示KLF8参与了缺氧条件下胃癌细胞多药耐药的发生。KLF8是SP1/KLF家族的成员之一，KLF8在多种肿瘤细胞中广泛分布，如乳腺癌、卵巢癌、肝癌等。因其KLF家族中蛋白的特异性结构，所以KLF8可以与下游靶基因启动序列上的CACCC盒或GT盒结合发挥促进或抑制作用。KLF8在肿瘤细胞中的高表达状态可以导致肿瘤细胞发生恶性变，患者预后较差。KLF8可以使肿瘤细胞发生EMT，增加了肿瘤细胞的侵袭和转移能力［13］;可以促进细胞增殖，使肿瘤细胞生长不断增加;可以增加肿瘤细胞的抗凋亡能力，导致治疗失败［14］;促进MMP9的表达，使肿瘤发生侵袭和转移;它还可以抑制E钙粘素的表达，促进EMT的发生。我们既往的研究发现缺氧通过上调KLF8诱导EMT的发生从而促进胃癌细胞的转移［15］。然而，关于KLF8与胃癌的肿瘤多药耐药的相关性尚无报道。我们的研究提示KLF8与耐药密切相关，可能对耐药起着重要的调控作用。进一步的研究发现外源性增加KLF8的表达可同时降低胃癌细胞及胃癌耐药细胞对化疗药物的敏感性，抵抗化疗药物诱导的细胞凋亡，增加化疗药物的泵出率;外源性干扰KLF8的表达，可逆转缺氧诱导的胃癌细胞多药耐药的表型。以上结果提示我们，KLF8参与了缺氧条件下胃癌细胞多药耐药表型的发生。目前对肿瘤细胞发生多药耐药机制的研究主要集中在以下几个方面:①耐药相关蛋白，此类蛋白主要有P糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)、肺耐药相关蛋白(lungresistanceprotein，LRP)、乳腺耐药相关蛋白(breastcancerresistanceprotein，BCRP)等，此类蛋白通过促进化疗药物的外排，抑制化疗药物进入细胞核，使化疗药物在细胞中局域化等途径参与了肿瘤耐药的形成［16－18］;②凋亡相关途径，通过抗凋亡蛋白Bcl－2/Bax的比率明显增加，抑制细胞凋亡，介导了耐药的发生［19］。而近年来，越来越多的学者发现肿瘤的多药耐药不仅仅是肿瘤细胞内部结构变化的结果，也是肿瘤细胞与外部环境相互作用的结果。本课题的研究者在以往的研究中发现了缺氧条件是促进胃癌细胞发生多药耐药的重要的肿瘤微环境，并首次报道了缺氧诱导因子HIF－1在缺氧诱导胃癌多药耐药中发挥重要作用［11］。通过我们的实验发现，缺氧通过上调KLF8参与了胃癌多药耐药发生，KLF8在缺氧与胃癌细胞相互作用下促进胃癌多药耐药发生过程中发挥了关键作用。进一步的研究发现KLF8通过增加化疗药物的泵出和抵抗凋亡而参与了胃癌细胞缺氧条件下多药耐药的发生。我们通过生物信息学分析发现在KLF8的启动子区域存在HIF－1的结合位点，因此HIF－1是否能够上调KLF8的表达;同时，KLF8作为转录调控因子，是否是通过上调P－gp家族和抗凋亡分子参与缺氧条件下胃癌多药耐药的机制将在未来的研究工作中进一步展开。
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作者：韩兆东阮月芹安新业孔祥华陈佳荣周玉明
【关键词】细胞
【关键词】流式细胞仪；临床应用；流式细胞术
流式细胞术（flowcytometry，FCM）是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物特性进行分析的方法。流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的综合结晶。在免疫学、血液学、肿瘤学等学科及临床研究方面得到广泛应用［1］。
FC500是由美国贝克曼库尔特（BECKMANCOULTER）公司2003年推出的临床及科研型流式细胞仪系统。该仪器可同时测定前向散射光（FORWARDSCATTER）、侧向散射光（SIDESCATTER）及利用一个488nm单束激光激发五个荧光染科所产生的荧光信号。因此，该仪器可对各个细胞进行相关的多参量的分析。
FCM的应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞的分子水平的研究，随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。
1FCM在免疫学中的应用
FCM广泛地应用于检测各种免疫细胞的表面标志及细胞内各种细胞因子等，通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态，指导治疗。有大量文献介绍了淋巴细胞在各种疾病中的变化。正常人群T淋巴细胞CD4/CD8比值大约为2∶1，但在人体细胞免疫力低下时可出现比例下降甚至倒置。B细胞CD19与机体免疫球蛋白呈正相关。NK细胞反应机体对病毒感染的细胞和肿瘤细胞的杀伤能力及巨噬细胞的杀菌活性。FCM通过对人白细胞抗原（HLA）配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体并进行骨髓或器官移植后免疫状态的监测。外周血HLAB27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎的发生有很大程度的相关性，运用HLAB27/HLAB7双标记特异性单克隆抗体检测抗原，可同时排除交叉反应，其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高［2］。用FCM检测阵发性睡眠性血红蛋白尿患者血细胞细胞膜上的CD55、CD59已能从病理上提供直接的证据，比传统的溶血试验具有更高的特异性和灵敏度。用FCM检测红细胞、粒细胞抗体及血小板表面的相关抗体，对确诊自身免疫性贫血、粒细胞减少症及血小板减少性疾病，均具有检测速度快、灵敏度高、特异性好的优点［2］。
2FCM在血液学中的应用
白血病分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充；是对白血病诊断、选择化疗方案和判断预后的重要依据；对白血病发病机制的研究也具有重要作用。由于白血病不同系列、不同分化阶段血细胞膜表面及浆内表达不同的分化抗原，且与相应正常骨髓细胞的表达存在差异，故应用FCM能很好的对白血病进行免疫分型，并能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信息，而这种变化常常是细微的，以至于常规FAB方法不能分辨。这使我们对血液肿瘤细胞的生物学特征有了更深入和更精确的认识。FCM还可用于血小板膜糖蛋白异常所致疾病的诊断，包括先天性或获得性血小板的疾病，评价活化血小板程度在血栓疾病和血栓前状态发生发展中的作用。用FCM通过对外周血网织血小板的测定，有助于血小板减少症的病因学诊断。可作为骨髓移植、造血促进因子和骨髓移植后骨髓血小板造血恢复有用的监控指标。
应用FCM检测某些免疫指标，能对再生障碍性贫血的发病机制进行研究。再障是一组由不同发病机制介导的骨髓造血功能障碍综合征。其发病机制复杂，目前尚未完全明了，但越来越多的临床和实验室证据表明免疫介导的造血抑制，是再生障碍性贫血最常见的病理之一。而且，具有免疫表型异常（如CD4/CD8倒置、CD8+活化T细胞或TCRγ，δ等异常增高）的患者临床表现相对严重，但免疫治疗相对有较好的疗效。
微小残留病灶（MRD）检查：白血病病人在获得血液学缓解后，体内还存在1010以下的白血病细胞。这样少量的白血病细胞常规的显微镜不能检出。在强化治疗和维持治疗后可逐步减少，但难以彻底清除，这是复发的根源。检测MRD是决定进一步治疗策略和选择采集外周血造血干/祖细胞自体移植及异基因骨髓移植时机的依据。
多发性骨髓瘤（MM）：多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生性疾病，正常浆细胞为CD38+/CD45dim-，使用CD38/CD45双标记检测外周血和骨髓标本，可以准确划定浆细胞群。通常使用CD38和CD45，结合轻链检查，对多发性骨髓瘤细胞进行分析。另外，正常浆细胞的表面标记为CD19+/CD56-，而多发性骨髓瘤细胞通过为CD19-/CD56+。这样，使用流式细胞仪对外周血或骨髓标本进行多参数分析，并计算浆细胞含量，对于多发性骨髓瘤的诊断和治疗评估有重要意义。
CD34的绝对计数：造血干/祖细胞移植加强烈化疗是治愈某些难治性疾病的有效方法；它不仅可以用于某些恶性血液病的治疗，而且还可以用于其他恶性实体瘤的治疗。骨髓移植（BMT）或外周血造血干细胞移植（PBSCT）的成功与否，除了与是否合并并发症有关外，移植物中CD34+细胞的数量和质量是快速成功植活的重要因素。精确测定CD34对于判断移植后的植活和选择GCSF动员外周血干细胞的采集时间，有着重要指导意义。
3FCM在肿瘤学中的应用
流式细胞术利用实体瘤标本或穿刺标本、胸腹腔液体、膀胱冲洗液、尿液、食道镜及支气管镜钳取的少量活检组织等对肿瘤细胞DNA会计师测定，解析细胞周期，通过肿瘤细胞异倍体测定，鉴别良性与恶性肿瘤，预测各种癌的预后，并能在化疗中对药物的选择，放疗中强度、时间的决定等起主要作用［5］。根据细胞周期分析结果，适当选用周期特异性药物或非周期特异性药物，可协助拟定治疗方案；根据化疗过程中肿瘤细胞DNA会计师分布直方图的变化，可了解细胞动力学变化，以此评估药物疗效。
多药耐药（MDR）的研究：白血病治疗及肿瘤化疗的失败在很大程度上是由于白血病细胞及肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药。因此，对白血病和肿瘤细胞耐药机制的研究具有重要的意义。但耐药的形成过程很多，主要有几个方面，包括药物吸收减少、细胞解毒作用增强、靶分子改变、DNA损伤修复能力增强、细胞内药物溢出增多、细胞凋亡的抑制等。多药耐药基因编码的P糖蛋白，是白血病细胞及肿瘤细胞抗药性的分子学基础，也是影响化疗疗效的主要障碍。利用FCM检测多药耐药基因，则可为药理学研究提供依据。
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【关键词】胶质瘤；细胞周期检测点激酶；反义寡核苷酸；放射敏感性
TransfectionofChk1AntisenseOligonucleotidetoGliomaIncreasestheApoptoticSensitivitytoIrradiation/LIYong，LAIRun-long，TANDian-hui，etal.//MedicalInnovationofChina，2012，9(13)：003-005
【Abstract】Objective：EffectonexpressionofChk1andchangesofcellcycleafterradiationinU251celllinewithantisenseoligodeoxynucleotide(ASON)wereobserved.Methods：TheU251celllinewastransfectedwithChk1senseandantisensechain-lipofectaminePLUScomplex.ThenirradiateditandmeasuredthechangesofthecellcycleandapoptosisinordertocomparethediferencebetweentheChk1senseandantisensechain.TheexpressionofChk1wasmeasuredbyWesternblot，andChk1mRNAwasmeasuredbyrealtimePCR.Results：TheexpressionofChk1proteinandmRNAmarkedlydecreasedafterransfectingU251celllinewithChk1antisenseoligonucleotide.TransfectingU251celllinewithChk1antisenseoligonucleotidecouldincreaseapoptosissignificantlyanddecreasecellcyclearrestmarkedlyinducedbyirradiation.Conclusion：ThesensitivitytoapoptosisisexcessivelyincreasedaftertreatedwithirradiationbytransfectionofChk1antisenseoligonucleotidetoglioma.Thiscanbethetheoreticalbasisforincreasingtheapoptoticsensitivitytoirradiationofglioma.
【Keywords】Glioma;Checkpointkinase;Antisenseoligonucleotide;Irradiation
First-author’saddress：FirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege，Shantou515041，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.13.002
目前研究认为，细胞周期检测点信号传导通路主要由ATM/ATR-Chk1/2-Cdc25A、Cdc25B、Cdc25c-Cdk轴组成[1]，Chk1是细胞周期检测点信号中最关键的效应蛋白激酶[2]。反义封闭Chk1激酶导致肿瘤细胞产生G2/M期检测点功能障碍，使细胞受损的DNA无法正常修复而更多地凋亡，从而增加肿瘤放、化疗的敏感性[3]。本课题利用反义基因技术抑制胶质瘤细胞中Chk1蛋白表达，消除照射后细胞周期阻滞，探讨其对胶质瘤放射敏感性的影响。
1材料与方法
1.1实验材料和试剂本课题采用人胶质母细胞瘤U251细胞株，由武汉大学典型物保藏中心提供。Chk1鼠抗人单克隆抗体购自美国SantaCruz公司；胎牛血清，DMEM和RPMI1640培养基为Gibco公司产品；LipofectamineTMandPlus脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司；MTT、碘化丙啶(PI)购自Sigma公司；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购自BD公司；辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG抗体和FITC标记羊抗鼠IgG购自武汉凌飞科技公司；哺乳动物蛋白提取试剂盒、蛋白定量检测试剂盒和Western杂交显影用增强化学发光试剂盒购自Pierce公司；逆转录试剂盒、TaqDNA聚合酶购自MBI公司；Chk1、β-actinTaqman探针购自美国Invitrogen公司；实时定量PCR试剂盒ExScriptRT-PCRKit为日本Takara公司产品。
1.2方法
1.2.1Chk1反义寡核苷酸的合成Chk1的正、反义寡核苷酸链[4]及FITC标记链经全程硫代磷酸修饰，由上海生物技术有限公司合成。Chk1反义寡核苷酸链碱基序列：5’GGCACTGCCATGACTCCA3’，正义寡核苷酸链碱基序列：5’TGGAGTCATGGCAGTGCC3’。
1.2.2U251细胞培养及转染U251胶质瘤细胞复苏后加入RPMI1640培养基中培养至对数生长期，胰蛋白酶消化后胞沉淀用RPMI1640完全培养基悬浮后移入培养瓶，台盼蓝染色细胞计数，调整接种浓度为1×105/ml~1×106/ml，置入5%CO2，37℃湿化培养箱中培养。实验共分四组：(1)正常组：细胞株未作任何处理；(2)对照组：U251细胞10Gy射线照射24h；(3)转染Chk1正义寡核苷酸组；(4)转染Chk1反义寡核苷酸组；(3)~(4)组转染24h后再用(2)组的照射方式处理。培养的细胞株分别进行FITC标记的全硫代修饰的Chk1正、反义寡核苷酸的脂质体法转染，转染后的细胞继续在含胎牛血清的RPMI-1640中继续培养。
1.2.3WesternBlot检测Chk1蛋白取上述各组收集的U251细胞，提取总蛋白。电泳前将样品与缓冲液混合后煮沸5min，作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过电转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭1h，鼠抗人一抗Chk1及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗37℃各孵育1h，最后用化学发光底物进行发光显迹。
1.2.4实时定量PCR法(Real-TimePCR)检测Chk1mRNA表达对上述各组处理的细胞提取总量RNA，并测定RNA的含量。以RNA为模板逆转录成cDNA，进行PCR反应，以β-actin为内参照。根据GenbankDatabase中Chk1基因的mRNA序列，应用PrimerExpress2.0设计软件针对Chk1和内参β-actin设计引物和Taqman探针序列。RealTimePCR反应条件如下：预变性：95℃10s；循环：95℃5s60℃34s，共40循环。结果采用Rotorgene3000型实时荧光定量PCR仪自带程序用双标准曲线法分析Ct(Cyclethreshold)值。Chk1及β-actin的PCR引物序列见表1。
1.2.5检测细胞凋亡及细胞周期细胞经上述各组处理后，观察各组细胞漂浮情况，在细胞周期阻滞最显著时间前后收获各组肿瘤细胞，严格按照AnnexinV/FITC-PI凋亡检测试剂盒上的说明操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期。
1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，采取t检验，以P
2结果
2.1反义封闭Chk1基因对Chk1mRNA及蛋白表达的影响实时定量PCR检测发现与空白对照组相比，反义封闭Chk1基因对Chk1在mRNA水平有下调作用，下调率为空白对照组的11%(见图1)，差异有统计学意义(P
图1Real-TimePCR检测转染后Chk1mRNA相对转录水平
图2WesternBlot检测转染后Chk1蛋白产物
图3WesternBlot检测转染后Chk1蛋白相对表达水平
2.2反义封闭Chk1基因对放疗作用下细胞周期和凋亡的影响细胞株经各组处理后，镜下观察细胞漂浮情况，发现转染反义寡核苷酸组较转染正义寡核苷酸组和未处理组的漂浮细胞明显增多，而转染正义寡核苷酸组和未处理组漂浮细胞无明显差别。收获各组肿瘤细胞进行AnnexinV染色后检测细胞凋亡情况，发现转染Chk1反义寡核苷酸后放射线诱导的AnnexinV凋亡率为(35.25±3.75)%，明显高于转染Chk1正义寡核苷酸组的(14.90±1.80)%，差异具有统计学意义(P
U251细胞未处理组G2/M期细胞占(20.76±1.75)%，放疗后出现G2/M期阻滞占(76.35±3.46)%，经放射处理后，细胞被阻滞在G2/M期。转染Chk1反义寡核苷酸组的细胞凋亡率为(16.16±2.89)%，明显高于转染Chk1正义寡核苷酸组(9.70±0.76)%(P
3讨论
细胞周期检测点激酶Chk1是DNA损伤修复通路中最重要的蛋白激酶，主要参与G2/M期细胞周期检测点信号传导通路的调控[3]。目前已有大量研究证实Chk1与人白血病细胞、乳腺癌MCF-7细胞、HeLa细胞、头颈鳞癌A253细胞的放、化疗敏感性密切相关[5-8]，然而Chk1与胶质瘤放疗敏感性的关系尚未见大量报道。本研究发现，接受射线照射后U251胶质瘤细胞主要表现为G2/M期阻滞。照射后肿瘤细胞产生的G2/M期阻滞与其DNA损伤修复有关，G2/M期阻滞为照射后受损伤的肿瘤细胞修复创造条件，而肿瘤细胞的损伤修复降低了放射线对肿瘤细胞的杀灭效应，从而导致放疗抵抗。
反义脱氧寡核苷酸(AsODN)是一种人工合成的单链DN段，根据碱基互补配对原理，能与特定的靶mRNA互补结合，选择性地封闭特定的靶基因，高度特异性的抑制靶基因的翻译与表达[9]。本实验合成的Chk1反义寡核苷酸，以全程硫代修饰增加反义寡核苷酸的稳定性，防止其在细胞外被RNA酶降解，并以脂质体法优化细胞的转染条件，提高其转染效率。Real-TimePCR检测发现，Chk1反义寡核苷酸对Chk1在mRNA水平有明显下调作用，WesternBlot检测结果与此相一致，转染Chk1反义寡核苷酸后同样可明显抑制Chk1蛋白的表达，以上结果表明，特异性灭活Chk1基因可显著增敏放射线诱导的U251肿瘤细胞凋亡。
本课题在特异性灭活Chk1基因对放疗作用的U251肿瘤细胞周期影响的研究中发现，Chk1反义寡核苷酸选择性封闭Chk1基因表达后，放射线诱导的肿瘤细胞G2/M期阻滞消失，细胞分裂周期被重新启动，同时细胞凋亡率显著增强，这进一步证明了选择性反义封闭Chk1基因能明显增加肿瘤细胞对放射线的敏感性。有研究发现，用Chk1抑制剂UCN-01处理U87胶质瘤细胞株后能阻断TMZ诱导的Chk1基因的短暂表达增强和肿瘤细胞的G2/M期阻滞，从而增加肿瘤细胞的凋亡[10]，这说明选择性抑制Chk1基因能增加U87细胞对化疗药物的敏感性。以上结果说明，Chk1基因在放、化疗中引起的肿瘤细胞G2/M期阻滞在细胞周期检测点信号途径中的作用是一致的，因此，特异性的反义封闭或抑制Chk1基因不仅能增敏肿瘤细胞的放疗敏感性，对其化疗敏感性亦有同样的作用。
放疗在杀伤肿瘤细胞的同时也会激活其内在的细胞周期检测点信号途径，增强细胞对放射治疗的抵抗性，寻找针对细胞周期检测点激酶Chk1的特异性抑制剂以提高肿瘤细胞对放疗的敏感性，正成为肿瘤治疗的一个重要研究方向，对未来肿瘤的基因治疗具有重要意义。Chk1基因在信号传导途径中因其对细胞损伤的修复作用，近年成为肿瘤治疗的新靶点，反义核苷酸技术为高选择性、高特异性地抑制Chk1靶点的功能提供了有力保证，选择性抑制Chk1基因为增强胶质瘤放射治疗的敏感性提供了理论依据。
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【摘要】目的:对小细胞肺癌患者癌胚抗原的检测结果进行分析,探讨CEA作为小细胞肺癌诊断的生物标志物的可行度。方法:选择我院2006年1月至2010年3月收治的80例小细胞肺癌患者作为研究对象,在治疗前后进行CEA检测。结果:同类型的小细胞肺癌患者CEA阳性率差异有统计学意义,广泛型小细胞肺癌患者的CEA阳性率显著较高。结论:小细胞肺癌的CEA检测具有灵敏度高,检测方法简便无创伤的优点,可作为早期诊断CEA及治疗后疗效的有效生物学指标。
【关键词】CEA;小细胞肺癌;检测;阳性率;肿瘤
小细胞肺癌(也称为未分化小细胞癌)是起源于大支气管上皮内原始神经外胚层细胞的中央型肺癌,占肺癌总发病人数的13%-25%,近年来发病率有逐步上升的趋势[1]。本研究对80例小细胞肺癌的患者测定癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA),并对CEA水平进行比较分析,现将结果报告如下。
1对象与方法
1.1一般资料:选择我院2006年1月至2010年3月收治的80例小细胞肺癌患者作为研究对象,其中男52例,女28例,年龄31-72岁,平均年龄(34.6±9.1)岁,均根据病理学检查或痰细胞学检查确诊。大多有咳嗽、咯血、胸闷胸痛、气短、吞咽困难等呼吸道症状,8例患者发生骨转移,5例患者发生肝转移,2例患者发生肾上腺转移。
1.2治疗方法:对局限性小细胞肺癌患者给予放化疗治疗,其中放疗照射野包括原发灶、肺门区域、纵膈、锁骨下,放射量为6000cGY。对广泛性小细胞肺癌患者进行单纯放疗处理。
1.3检查方法:患者在入院后行胸部正侧位片、超声、心电图、血常规检查,怀疑有骨转移的患者行骨扫描和骨髓穿刺检查,部分患者行进一步腹腔CT检查。所有患者在治疗前采集空腹全血5ml,离心分离后将血清置于-20℃冰箱待进行CEA检测,并确保样品无溶血,无严重脂血。部分患者在治疗后继续定期检测CEA水平。CEA单克隆抗体购于北京生物制品研究所,采用化学发光法测定,检测仪器为罗氏E170型化学发光免疫分析仪,正常值为10.0ng/ml,所有操作均严格按照仪器及试剂说明书进行。
1.4统计处理方法:采用SAS9.2统计软件包进行分析,计量资料以(x±s)表示,两组均数比较采用独立样本t检验,计数资料采用率表示,采用x2检验对各组阳性率进行比较。P
2结果
不同类型的小细胞肺癌患者其CEA测试值差异无统计学意义(t=-0.872,P=0.386)。但不同类型的小细胞肺癌患者CEA阳性率差异有统计学意义(x2=8.353,P=0004),广泛型小细胞肺癌患者的CEA阳性率显著较高,见表1。
3讨论
小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)是肺部神经内分泌肿瘤中恶化程度最高的一类,对放疗较为敏感。小细胞肺癌早期多无明显症状,容易被患者忽视[2],且发病进展迅速,容易发生骨转移和胸部转移,患者就诊时多为晚期,如发现和治疗较晚,可在2-4月内死亡[3]。因此小细胞肺癌的早期发现和早期诊断对于提高治疗效果十分重要。
癌胚抗原是胃癌、肠癌、肺癌、结肠癌等恶性肿瘤的敏感性抗原。肺癌中CEA多为高表达,较少受患者年龄、性别、肿瘤形态、分化程度及临床分期的影响,而与肺癌的浸润广泛程度有密切的关系,是可靠性较好的生物标志物[4]。本组患者中有6例患者在化疗后CEA升高,在缓解后又降至正常水平。1例患者在化疗后病情发生恶化,检测发现CEA明显上升,最高时上升到280ng/ml,这可能与化疗后肿瘤细胞崩溃,短时间内CEA释放量增多有关[5]。说明CEA可在一定程度反映病情的变化情况,可以作为治疗效果判定的参考指标,这也提示我们在治疗后应定期随访检测CEA的变化,如随访1年CEA均无明显上升,则可视作治疗成功。对于CEA较高(如大于10ng/ml)的患者,应注意检测是否有转移病灶或隐匿病灶,必要情况可考虑进行预防性脑部放射性治疗,以防止肿瘤发生脑部转移。局限型小细胞肺癌的CEA阳性率仅为6.9%,而在广泛型小细胞肺癌患者中有较高的表达(318%),两者有显著差异,与国内其它研究结果一致,说明CEA可以有效的用于小细胞肺癌的类型鉴别[6]。总之,小细胞肺癌的CEA检测具有灵敏度高,检测方法简便无创伤的优点,动态观察CEA变化可反映病情变化,因此CEA可作为早期诊断CEA及治疗后疗效的有效观察指标[7]。
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