我们所处的世界是一个多彩的世界，人类与各种动植物共存在这个地球上，和谐共生。虽然人类要生存和发展，就离不开对生物资源的开发利用，但是如何合理开发利用、怎样保护生物资源，特别是高原等地理气候环境特殊地区的生物资源，使之能够与人类的需求和利用和谐发展，达到生物资源可持续发展与生态环境保护并行的境界，则是一门需要深入研究的学问。中国科学院西北高原生物研究所的韩发研究员，就为此奉献了30几年的心血。
高原生态的守护神
韩发研究员是我国的植物生理生态学家，他1953年出生，自上海复旦大学生物系生物化学专业毕业后，1978年起调入中国科学院西北高原生物研究所，一直从事青藏高原上植物生理生态学和特色生物资源的开发利用与关键技术研究工作至今。
在韩发研究员的科研生涯中，他先后从事了高原植物抗性生理学、植物逆境生理生态学、植物生物化学、恢复生态学、保护生物学、野生植物人工驯化培植技术、青藏高原特色植物资源开发与加工技术等多个方面的研究。在极端高寒低温、干旱缺氧、强紫外线辐射的高海拔地区，他对青藏高原典型高寒植物的生理生态学进行了长期的野外定位观测和比较试验研究，分析研究了青海主要高山植物的抗性生理学特征和生理生化特性，对植物新型生长调节剂ABT、GGR等在农作物和牧草上的退化植被恢复和增产应用技术等进行了较深入的生产试验和示范推广。
韩发研究员的工作成绩不仅限于此。长期以来，他就特别关注国家关于西部大开发的战略部署和要求，始终坚持中国科学院科研必须面向国家战略需求和必须服务地方经济建设的指导方针。多年来，在青藏高原特色生物优势资源的研究与开发利用方面产出了优秀科研成果。他在高原冰缘植物对极端环境胁迫抗逆性的生理特征研究、高山植物对极端高寒低温和强UV-B辐射胁迫的生理生态响应、高寒草甸主要植物抗逆性的生理生化基础和适应机制研究、三江源区退化草地主要成因与植被恢复新技术研究、青藏高原独有特色植物微孔草和青海冬虫夏草资源的调查研究开发、开发与加工技术、以及野生微孔草人工驯化品种选育和栽培技术等方面均已经获得了众多宝贵的实验研究资料和研究成果。
关注资源开发与研究的同时，韩发更没忘注重生态环境的保护，将开发利用与维护生态平衡相结合，为维护高原生物链、生态环境安全做出了积极的贡献。韩发研究员用自己的切身行动，30年如一日，守护着我国西北高原的生态平衡和生态安全。
成绩卓著的科学家
韩发研究员凭借着党对他的培育、对青藏高原上生物、生态的熟悉和热爱，以及忘我的研究、奉献精神，先后主持承担并出色完成了国家重大科技攻关计划项目、省部级重点科技攻关项目和国家自然科学基金、中科院、国家林业部等的各类科研项目课题20余项，获得部级和省部科技进步奖、科技成果奖、应用推广奖等12项，取得部级和省部级科技成果9项，申请国家发明专利2项，130余篇，培养研究生21名。此外，他还先后研发制成植物光合促进剂、环糊精生长调节剂、微孔草油降高血脂软胶囊等新产品5项。
在所获得众多成绩中，韩发先后耗费心血完成的专著《中国冬虫夏草的现代研发与应用》得到了社会各界的广泛好评；《高寒草甸生态系统论文集》获得了中国科学院二等奖；他作为主要贡献者完成的《ABT生根粉系列研究与推广》项目荣获国家科学技术进步奖特等奖、主持完成的《青藏高原不同海拔矮嵩草抗逆生物学的比较研究》荣获了科技部中国“九五”优秀科学研究成果奖；由韩发作为主要贡献者之一完成的《绿色植物生长调节剂（GGR）系列的研究开发与应用》项目，获得了国家科技进步二等奖，与此同时，他承担完成的《ABT与GGR系列研究与推广》项目荣获国家林业局应用推广特等奖。
多年来，韩发的辛勤钻研和科技创新工作为揭示青藏高原高寒植物适应与抗逆的生命现象、过程及其本质、为探索高寒草地退化生态系统的恢复与重建、为开发利用青藏高原的特色生物资源与关键加工技术及其保护途经提供了重要科学依据。
2011年，韩发研究员主持完成的国家科技攻关计划项目《三江源区典型退化草地的植被恢复试验和新技术研究（项目编号：2005AB901A20）》已顺利通过省级科技成果鉴定，其科研技术达到了国内的领先水平。这一项目首次以三江源中心区的青海省果洛州地区典型的高寒草甸退化草地为试验区，依据轻度、中度、重度退化草地群落特征、生长特点和土壤状况，选用新型绿色植物生长调节剂等6种植被恢复新技术进行了应用试验和示范推广，在促进高寒草甸典型退化植被的快速恢复技术方面获得了成功。与此同时，他主持承担完成的国家“十一五”科技攻关计划项目《三江源区典型退化草地的植被恢复试验和新技术研究》，不仅为探索揭示三江源典型退化草地的快速恢复重建和高寒草地植被适应与抗逆的生理生化机制积累了第一手试验资料，而且为该地区退化草地植被的快速恢复提供了一条新的有效途径和技术示范样板。同时，项目首次从植物生理生态和生物化学方面，探讨了三江源区高寒低温生境下典型退化草甸应用植被恢复新技术对其恢复过程中土壤酶活性和植物抗氧化系统的影响和生理生化响应，为探索揭示典型退化草地的快速恢复途经和高寒草甸植物适应与抗逆的生理生化机制积累了第一手试验资料。
成果转化的推动者
当一项科研成果完成产业化转化时，才是其实现利国利民的最大价值的时候。韩发作为一名国家二级研究员，非常重视研究成果的开发、利用和产业化转化，呕心沥血致力于此，其中他的团队在我国特有植物资源微孔草和冬虫夏草的研究与开发方面已取得了重大进展。通过大量考察研究，韩发证明了微孔草是一种主要分布在青藏高原高海拔高寒地带特有的优质高效药用野生新资源，具有极高的药用保健价值和神奇独特的作用功效，应用市场前景广阔，经济生态社会效益显著。由国家科技部联合九部委制定颁布的指导中国未来5～15年《中国农业科学技术政策》中，微孔草被列为我国优质新油源开发的重点领域和关键技术研究。所以，对微孔草资源的研发与应用不仅具有极高的应用价值，而且对促进西部特色生物经济产业的发展具有重要意义。
经过韩发团队的长期科学考察、化学分析、药理实验、临床观测和产品研发等研究工作，在微孔草生物学特性、人工驯化培植、资源综合利用、籽油提取技术和产品研发方面已取得了许多科研成果，为促进我国这一特色生物资源的开发应用与产业化奠定了良好的基础。在科技部、国家基金委、中科院等部门的支持下，韩发研究员的课题组完成了多项微孔草应用基础、种植方法、提取技术和综合开发方面的研究课题，报告20余篇，申请国家发明专利2项，选育出微孔草新品系3个，完成地方技术规程和标准3项，2011年时还建立了野生微孔草的仿生栽培方法和微孔草籽油的超临界CO2提取技术，目前已有5项微孔草的研究成果通过了省级科技完成成果鉴定。
【关键词】微生物群落宏基因组时间序列
高通量测序方法的改进使得关于各种环境下微生物群落随时间变化情况的纵向研究大大增加。这些时间序列研究可以提供对于微生物群落稳定性的独特生态见解，同时也能了解无法以其他方式获得的微生物群落应对扰动的响应。
1通过时间序列数据了解微生物
在近期的纵向研究中，大约一半的微生物群落有负斜率时间衰减曲线，也就是说，这些微生物群落间的不同随时间增加为增加。此外，微生物群落多样性随时间变化的情况与环境有关，在相同的环境下，其多样性差异不大，在不同的环境中，微生物群落多样性差异很大。例如，土壤和酿酒厂废水中微生物多样性最低，然而人类手掌和婴儿肠道的微生物多样性最高。对海洋微生物进行的长期研究表明，相对与其他因素，微生物群落中的个别成员会受到季节变化的强烈影响。同时，另一些微生物群落在定殖后会经过一系列的可预测状态，例如在牙斑的形成过程中，耐氧菌的生存为厌氧菌提供环境。在某些情况下，例如婴儿肠道菌群的定植，虽然微生物群落在初始阶段变化连续变化，但最终会稳定在类似的状态。
微生物群落往往演变成一个稳定的组合状态，这一状态会受到外界因素的变化而变化，例如抗生素或益生菌治疗会影响肠道微生物群落的组合状态。微生物彼此之间及微生物与环境之间的复杂相互作用是影响微生物生态的主要贡献者，目前探索上述关系的方法主要是网络推断技术。
2微生物时间序列网络
近期的研究提供了许多可以从时间序列数据构建共生网络的方法，从结合置换检验的相关性分析[1]到基于超几何分布的相似性评估[2]，以及分析影响类群丰度多因素的多元回归分析[3]。这些静态网络推断技术可应用于构造动态模型。例如，微生物群落的动态变化在数学上往往符合广义的Lotka-Volterra方程，其将微生物丰度的变化作为分类群生长率和微生物间相互作用强度的函数。方程中的参数可以利用对时间序列数据进行多元回归确定。
然而，上述方法忽略了时间序列提供的时间点排序和依赖性的附加信息。这些特性只能通过动态的方式加以利用。
局部相似性分析（LSA）采用动态规划算法，在最大限度上确定两个序列的相似性得分，以判断两个序列的相似关系，同时LSA还可以检测两个时间序列之间关系的滞后。例如，LSA被用于预测噬菌体和他们的宿主之间的关系。动态贝叶斯网络在模型中将每个变量的当前值作为其父变量之前时间点的函数。因此，动态贝叶斯网络可检测包括循环在内的动态相关性，相比标准贝叶斯网络，动态贝叶斯提供了更强大的建模框架，尽管它增加了计算成本，可扩展性有限，然而在识别正确模型时其对数据的解释良好。另一组的动态网络推断技术基于交叉预测，它对如何通过同一系统内的其它时间序列预测某一的时间序列的将来这一问题进行量化，这类方法包括Granger因果关系[4]和新型聚合杂交映射。
上面提到的所有方法在推断物种相互作用时都从整个时间序列出发构造单一网络。然而，物种之间的相互作用可能随时间改变，因此其网络结构也会随之变化。时变网络推断技术的目的就是研究变化发展的网络结构，非平稳和随时间变化的动态贝叶斯网络，可用于推断在网络结构随时间发生的变化。
3结语
在微生物时间序列分析中，时间间隔的长短会影响微生物关联关系，纵向分析中的许多方法需要短期和定期采样间隔长的时间序列，目前可用的宏基因组时间序列往往很短（几个时间点），跳空（失踪的时间点），稀疏（零富）和嘈杂，因此需要进行预处理，包括：规范，插值和去趋势，使时间点等距等方法。因此如何更好的选取取样间隔是一个需要解决的问题。网络结构对状态转换的影响的研究尚处于起步阶段。未来的研究方向是探索随时间变化的网络是否有“预警”的属性，即网络结构可以预测某种转变是否发生。
尽管面临挑战，微生物时间序列的研究已经提供了一套丰富的分析工具，有助于了解系统动力学和应对扰动，构建预测模型。应用这些强大的技术于微生物学和宏基因组学，在解决遇到的纵向时间序列和相关建模难题上时有很大的帮助。
参考文献：
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【关键词】微咸水；膜下滴灌；土壤水盐；作物产量
我国旱作农业以灌溉为主，需要大量的地表或者地下淡水，而面临水资源短缺的情况下，在西北干旱半干旱地下淡水超采区，地下咸水和微咸水（矿化度2～5g/L）分布广泛，而未有效开发利用[1-2]。诸多国内外研究证明，合理科学地开发利用微咸水灌溉，有利于缓解淡水资源短缺、抗旱增产、有利于淡水存储、地下水资源更新和生态环境建设与保护[3-5]。在干旱半干旱地区，已将覆膜灌溉、滴灌和微咸水灌溉有机地结合在一起形成一种具有生命力的节水灌溉方式。较其他灌溉方式微咸水膜下滴灌具有一定优势。滴灌能够精密控制作物所需水分，降低土壤水分在深层的渗透损失，还可使地下水水位下降；而覆膜能够减少土壤蒸发量调节土壤温度，改善作物品质和提高作物产量。然而，微咸水灌溉不当会破坏土壤水盐平衡，导致土壤盐碱化。近年来，安全高效、科学合理地利用微咸水灌溉成为专家学者关注的热点问题。因此，进行微咸水膜下滴灌条件下土壤水盐分布特征以及作物生长、生理生态和作物产量方面的研究，对于干旱半干旱区农业和土壤环境的可持续发展具有重要的科学意义和实际应用价值。本文系统分析和总结了微咸水膜下滴灌条件下土壤水盐分布特征、作物生理生态及产量等的影响，为深入开展微咸水膜下滴灌技术理论和实践提供指导和帮助。
1微咸水膜下滴灌土壤盐分动态
膜下滴灌技术研究起源于20世纪70年代。多年来，国内专家学者在干旱区开展了大量微咸水膜下滴灌室内外试验，取得了诸多研究成果。杨树青[6]等认为，不同作物的灌溉水矿化度临界值不同。淋洗灌溉定额，小麦灌溉水矿化度在5g/L、玉米4g/L、葵花7g/L时盐分在40～100cm土层明显增加。柴付军[7]等研究了微咸水不同灌水频率对膜下滴灌土壤水盐分布的影响，认为高频灌溉可以显著抑制土壤返盐。王相平[8]等以10a的模拟结果认为采用1.5mg/cm3矿化度微咸水进行长期灌溉，不会引起0～100cm土层土壤次生盐渍化。吴军虎[9]等在库尔勒采用2.81g/L微咸水对棉花进行膜下滴灌试验，结果表明，375mm灌溉水量处理滴头下方0～20cm土壤含盐量均有减小，对棉花根区土壤盐分淋洗效果最好。李金刚[10]等研究表明，-20kpa和-30kpa微咸水膜下滴灌灌水下限适中，能较充分地淋洗膜内表层土壤盐分，不会导致微咸水中的盐分滞留累积。
虽然在微咸水膜下滴灌的研究国内学者取得了一定进展，但由于土壤水盐运动受到土壤剖面的物理、化学和生物特征的时空变化、作物根系以及人为管理的影响，膜下滴灌土壤水盐动态在比较单一的土壤环境中也相当复杂。田间土壤水盐运移及贮存范围、位置以及湿润体形状是设计灌溉制度的重要参数。而在生产实践中，往往忽视了决定土壤湿润体体积的土壤理化性质、滴头流量、间距以及灌水频率和土壤初始含水量这些重要因素的基础数据，且常根据室内扰动土的模拟试验进行大田试验设计，并指导灌溉，过量计算湿润体体积导致降低滴灌系统效率，浪费水以及肥料；或者过少计算湿润体体积导致水盐胁迫，抑制作物生长，从而造成资源浪费。尤其是微咸水覆膜条件下，土面蒸发受到抑制后，滴灌灌水时间和频率对土壤水盐运动的影响研究尚少。同时，作物的根系吸水作用也是一个复杂的体系。植物根系与土壤水盐的相互作用这一至关重要的问题，还未能解决。田间土壤水盐运移的准确分析与评价是制定和实施当地微咸水膜下滴灌措施的前提和依据。
2微咸水膜下滴灌对作物形态发育的影响
合理地控制微咸水膜下滴的矿化度，对耐盐作物生长及其产量不会产生很大的影响，微咸水可替代部分淡水资源进行农业生产。宋有玺[11]在民勤实验表明，膜下滴灌微咸水矿化度低于6g/l处理比淡水灌溉更有利于棉花叶面积生长，微咸水矿化度在2g/l时，促进棉花干物质的积累。陈琳[12]等研究结果表明，随着微咸水膜下滴灌灌溉水矿化度的增大，黄瓜的光合指标与水分利用效率均降低，干物质积累增多，品质有所提升。焦艳平[13]研究了不同矿化度微咸水灌溉对大白菜生长和土壤盐分累积的影响，表明各处理间白菜株高不存在显著差异。微咸水灌溉棉花的研究表明，土壤盐分作用下侧根的数目减少，功能叶片叶色灰暗，显蕾、开花、果枝、棉铃数量均减少。玉米幼苗期用NaCl质量浓度为3g/L的水溶液处理时，对幼苗生长有所促进，对干物质累积没有抑制作用，而大于3g/L时，明显抑制幼苗生长。
作物遭受盐分胁迫后，几乎都表现出作物经济产量的下降。但根冠的干物质分配、叶面积指数、株高等情况不一，可能是与作物耐盐程度与遭受盐分胁迫程度相关。轻度盐分胁迫在一定程度上刺激作物根系发展，导致根冠比增大。以往研究多数是从农学、栽培、作物育种、生理学等角度揭示作物拒盐、耐盐、适盐的生理生化机理。不同地域、不同土壤条件下，作物的耐盐能力有所不同。同樱在灌溉管理中，也应考虑作物的耐盐力。当植物处在较适宜的土壤水分范围，可以缓解水盐不平衡效应，降低盐分对作物生长的危害。而植株蒸腾耗水作用会随较大的空气湿度减弱，也会在一定程度上缓解盐害对植物生长的抑制作用。
3微咸水膜下滴灌对作物产量的影响
研究表明膜内滴头下20cm深处的土壤基质势下限达到-20kpa时，随着微咸水灌溉量增加番茄产量显著增加。张豫[14]等认为，从产量效应角度来看，灌溉水矿化度为6.85g/L时，不适宜在塔里木盆地进行棉花膜下滴灌。黄金瓯[15]认为，咸淡水轮灌与淡水处理比较，棉花产量没有明显减少。黄丹[16]等试验结果表明，淡淡咸咸微咸水与淡水组合滴灌，节约淡水率68%，剖面积盐率56.2%，相对作物增产率7.3%。由前所述，使用一定矿化度阈值以下的矿化度微咸水进行膜下滴灌，以及正确的农作措施管理情况下，土壤盐分累积状况不会威胁到作物的生长，不会造成作物产量的严重减产。一般来说，首先要针对不同的农作物种类分别确定适宜不同地域的微咸水矿化度阈值，例如冬小麦，一般微咸水矿化度3～4g/L用于灌溉是可行的，棉花不超过6g/L咸水微咸水可以用于灌溉。考虑到环境、气候、作物以及土壤的复杂性，不同参数情况下，微咸水膜下滴灌对作物产量的影响，是需要全面深入研究的问题。
4结论与展望
微咸水膜下滴灌技术作为一种极具潜力的开源途径，面临机遇与挑战并存的局面。高产、节水以及土壤环境问题之间的矛盾始终制约着微咸水膜下滴灌技术的推广应用。未来，应继续深入研究微咸水灌溉对土壤、作物以及地下水环境的影响，制定相关的灌溉水矿化度阈值和土壤盐分标准，确保作物生长、产量、品质等不受盐分胁迫影响，同时确保土壤条件不会恶化，使我国微咸水膜下滴灌农业可持续健康发展。
（1）探寻微咸水膜下滴灌条件下作物―水盐相互作用机理；覆膜条件下，土面蒸发受到抑制后，滴灌灌水时间和灌水频率对土壤水分盐分运动的影响问题；揭示植物根系与土壤环境的土壤水盐反作用规律。
（2）结合气象等自然条件及作物特性，应用数学和数值模型，合理配置有限的水资源和土地资源，建立安全高效的微咸水膜下滴灌的土壤水盐调控技术体系和灌溉模式，并在区域上推广应用。
（3）作物遭受盐分胁迫是个综合、复杂的过程。观测作物不同生育期生长形态和生理生化指标的动态变化及其响应调节关系，对于判别作物遭受盐分胁迫的程度、寻求作物耐盐阈值，揭示作物适盐、拒盐、抗盐机理。从灌溉角度出发，尤其是微咸水膜下滴灌条件下盐胁迫作用机理以及作物响应特征与调节机制等方面研究有待进一步研究。
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关键词：重金属污染；土壤微生物；微生物多样性；研究方法
中图分类号X172文献标识码A文章编号1007-7731（2017）13-0036-03
StudyonSoilMicrobialDiversityinHeavyMetalContaminatedSoil
LiYan1etal.
（1AnhuiHuajingResourcesandEnvironmentTechnologyCo.，Ltd.，Hefei230094，China）
Abstract：Inthispaper，theresearchmethodsofmicrobialdiversityofheavymetalcontaminatedsoilsinrecentyearsaresummarized，andtheiradvantagesanddisadvantagesandtheirapplicationareanalyzed.Theresearchmethodsofmicrobesarealsodiscussed.
Keywords：Heavymetalpollution；Soilmicrobes；Microbialdiversity；Researchmethods
近年来，由于农药、化肥的大量使用，以及冶金、采矿业的迅猛发展，土壤重金属污染日趋严重[1]。重金属污染不仅会严重影响农产品以及农作物的品质，而且会通过食物链进入人体，危害人体健康。土壤是微生物栖息的最重要环境之一，提供了微生物生长所必要的营养物质。土壤微生物种类十分丰富，主要分为细菌、真菌、古菌以及放线菌等。土壤微生物是土壤有机质以及土壤养分C、N、P、S等循环转化的动力，参与土壤中有机质的分解、腐殖质的形成、土壤养分的转化循环等[2]。土壤微生物在土壤生态系统中扮演者十分重要的角色[3]，对环境的变化反应灵敏[4]，其群落多样性和相对组成，是评价环境质量的重要参数[5]。一旦土壤生态系统受到污染，土壤微生物就会发生相应的变化[6]。有研究报告指出，土壤重金属污染能明显影响土壤微生物的活性及结构[7]，李晶等[8]研究也表明，土壤微生物对重金属胁迫特别敏感，可通过微生物群落结构的变化来反映土壤质量和健康状况[9]。因此，研究土壤微生物具有十分重要的意义。本文对研究微生物传统以及各种新型研究方法进行了分类介绍，并对各种方法的优缺点以及适用场合进行说明。
1土壤微生物研究方法
1.1传统的分离纯培养和稀释平板计数在固体琼脂培养基上接种培养微生物，可利用微生物的表面特征差异，在固体培养基上对微生物进行分离纯化，也可利用该方法对微生物在平板上进行简单的计数[10]。同时可以通过配制不同成分的培养基对微生物进行筛选驯化，从而得到我们需要的菌种。此种方法的优点是成本低，便于对微生物的状况做出初步的判断。缺点是由于自然界中存在大量的不可培养的微生物，且存在很多对温度要求苛刻并微生物，如嗜低温菌和嗜高温菌，传统的固体培养基的培养温度并不能满足这些微生物的生存所需温度。
1.2Biolog微平板法Biolog微平板原理是基于测定微生物对单一碳源利用程度的差异来表征微生物的生理特性[11]。Biolog微平板由对照孔和95种不同单一碳源孔组成并在其中添加染料，当接种纯培养的菌液时，其中一些孔的营养物质被利用，使各孔呈现出不同的颜色，从而形成微生物特有的代谢指纹，可通过与标准菌种的数据库做对比，从而可鉴定出被测菌种。与传统培养方法相比，此方法可以估算微生物群落代谢多样性和功能多样性。同时可根据各孔的颜色差异来反映出微生物群落的均匀度，从而可以反映出群落的稳定性[12]。该方法的缺点是当环境差异不大时，这些指数并不能较敏感地区分菌群之间的差异[13]。同时由于不同的生长和竞争的结果，菌种之间会相互影响导致种群发生变化，影响测定结果[14]。
1.3磷酸脂肪酸分析法（PLFA）磷酸脂肪酸存在于活细胞的细胞膜中，具有属的特异性，不同属的微生物通过不同生化途径而形成不同的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。因此，土壤中的PLFAs组成和含量变化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的动态变化。通过对微生物的磷酸脂肪酸进行提取，并依据其中的特征脂肪酸指示的微生物种类[16]，可对土壤中微生物群落特征进行表征。此种方法具有对试验条件要求低、无需对微生物进行培养、测试功能多和稳定性好等优点[17]。但PLFA法也具有一定的局限性。该方法只能鉴定到属，PLFA图谱并不能给出一个实际的微生物种类组成，仅能反映微生物群落的概图[18]；另外，该方法容易受微生物生理状态影响[19-20]；古菌不能使用PLFA图谱进行分析，因为它的极性脂质是以醚而不是以酯键的形式出现[21]。同时由于目前尚未建立土样中所有微生物的特征脂肪酸，并且在很多情况下，还无法确定土样中某些脂肪酸与特定微生物或微生物群落的对应关系[22]。
1.4变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）该技术是以复杂的环境样品如土壤为研究对象，直接提取微生物DNA，利用通用引物进一步对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增产物开展DGGE凝胶电泳分析[23]。DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开[24]。该方法的原理是根据DNA的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所需要的变性剂浓度不同。在普通的聚丙烯酰胺凝胶基础上加入变性剂，根据其迁移行为决定于其分子大小和电荷的原理能够将长度相同但序列不同的DN段区分开[25]。该方法具有可靠性高、重现性强、方便快捷、分辨率高等优点[26]，但同时也存在一定的局限性。DGGE还不能全面分析土壤中全部微生物，该方法只能检测出土壤中相对丰度大于1%的微生物[27]；同时DGGE对实验要求较高，凝胶浓度、温度、电压等电泳条件选择不当时，就会发生共迁现象[26]，即同一条带不止包含一种微生物，微生物的种类被低估。
1.5高通量测序技术高通量测序技术也称“下一代”测序技术，1次并行能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技术为代表[28-29]。该技术对于研究土壤微生物具有极大的意义。该技术极大地降低了微生物测序成本，实验了大规模土壤微生物直接测序[30]；同时该方法极大地提高了测序通量，丰富了研究的信息量，便于研究者更加深入地了解所研究课题。但同时该方法也存在一定的局限性，主要局限性如下：海量数据分析难的问题，该测序方法所测数据之深，所获信息之大，都极大地加大了实验研究者分析数据的难度；数据去伪存真难的问题，在土壤微生物高通量测序中，存在物种丰富度被高估的情况[30]，对高通量测序结果去伪存真，探索新的统计学方法成为研究者面临的一大难题[31]。
1.6基因芯片技术（GeoChip）基因芯片（GeoChip）是研究土壤微生物非常有效的技术手段，作为新一代的核酸杂交技术，可用于检测环境微生物参与物质循环、污染物降解等过程中参与的功能基因[32]。该方法是在芯片上含有编码各种与生态学和生物功能过程或生物降解作用有关酶的基因[33]。由此可见，功能基因芯片为土壤微生物研究提供了全新有力的技术分析工具，有利于更加有效地利用微生物对污染土壤进行修复[34]。基因芯片技术具有高密度、高灵敏度、自动化和低背景水平等显著优点[35]。但是任何技术都存在一定的局限性，基因芯片技术也不例外。该技术虽能检测出微生物在生物学过程中所发挥作用的功能基因，但是却不能直接表征微生物的群落多样性组成和丰富度。应结合DNA与mRNA测序，可以更加真实全面地反映土壤微生物群落结构信息及其生理活动[34]。同时该方法在取样、标记、杂交条件、图像处理、数据归一化以及所得数据的质量评估等都会带来很多误差[36]。
2不同方法在重金属污染土壤中的应用
刘云国等[37]在湖南临乡桃林矿区土壤中采用稀释涂布法在马丁固体培养基上筛选出一株高抗铜、锌菌株；张秀等[38]利用Biolog微平板法来分析生物质炭对镉污染土壤微生物多样性的影响；孙婷婷等[39]利用磷酸脂肪酸分析法来分析羟基磷灰石-植物联合修复对Cu/Cd污染植物根际土壤微生物群落的影响；郑涵等[40]利用PCR-DGGE分析方法对锌胁迫对土壤中微生物群落变化的影响进行了评价分析；江玉梅等[41]利用Illumina平台高通量测序技术分析重金属污染对鄱阳湖底泥微生物群落结构的影响；路桃香对植物非根际土壤微生物进行454高通量测序。
目前对于微生物研究方法有很多种，有最先进的技术，也有传统的实验方法，每种方法都各有优缺点，因此，在研究土壤微生物时，应结合土壤特征以及研究目的合理选择研究方法。如条件允许的情况下，可以结合多种技术方法同时使用，可以更好地研究土壤微生物的群落特征。
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关键词：电子显微镜技术；农学专业；教学；应用
中图分类号：G642.0文献标志码：A文章编号：1674-9324（2014）05-0069-03
电子显微镜包括透射电子显微镜和扫描电子显微镜，它是一种研究物体超微结构精密分析仪器，主要用于研究样品的内部结构和表面形态特征的变化，在动物、植物、生物、医药、物理、化工材料等自然科学领域的科学研究中发挥着重要作用[1，2]。近年来，随着电镜技术的不断发展与其他技术学科的紧密结合，在动物医学、动物科学、农学、园林、食品与药品、草业、水利、机械交通等农学门类自然学科专业领域的应用更加广泛。因此，在农业高等院校本科和研究生教学中开设《电子显微镜技术》课程，可以为各专业学科的教学提供技术支持。新疆农业大学将《电子显微镜工作原理与应用》课程设定为全校本科生和研究生的公共选修课，有效地提升了各学科整体教学质量和科研能力。
一、《电子显微镜工作原理与应用》课程的教学内容与要求
1.《电子显微镜工作原理与应用》课程的教学内容。《电子显微镜工作原理与应用》课程理论教学内容包括：电子显微镜的概述、组织超微形态结构和功能、透射电镜的结构和工作原理、透射电镜的操作和使用、透射电镜的样品制备、扫描电镜的结构和工作原理、扫描电镜的操作和使用、扫描电镜样品制备技术、电镜样品制备实例，共九个部分。本科生理论课教学10学时，研究生理论课教学20学时。
《电子显微镜工作原理与应用》课程实验教学内容包括：电子显微镜的结构和使用操作、生物样品透射电镜制备方法、材料样品透射电镜制备方法、生物样品扫描电镜制备方法、材料样品透射电镜制备方法，共五个部分。本科生实验教学20学时，研究生理论课教学30学时。
2.《电子显微镜工作原理与应用》课程的教学要求。（1）《电子显微镜工作原理与应用》课程本科生教学要求。本科生教学中主要要求学生了解电子显微镜的结构和操作原理，动植物组织细胞超微结构、功能和细胞表面形貌特征，理化材料的晶体结构和形貌特点，常规生物样品和理化材料的制备技术方法。在实验教学中要求学生了解仪器的操作方法、生物样品的制备过程，掌握常规生物样品和理化材料的制备技术方法，使学生能够掌握电子显微镜技术在动植物组织细胞超微结构和理化材料研究中的应用。（2）《电子显微镜工作原理与应用》课程研究生教学要求。研究生教学中不仅要求学生要掌握电子显微镜的结构和操作原理，动植物组织细胞超微结构、功能和细胞表面形貌特征，理化材料的晶体结构和形貌特点，常规生物样品和理化材料的制备技术方法，而且还要求学生掌握电子显微镜的细胞化学定位技术、扫描电镜临界点干燥技术等特殊检测技术。
在实验教学中要使学生掌握仪器的操作方法，如超薄切片技术、半薄切片技术、负染技术、细胞化学定位技术、扫描电镜临界点干燥技术、离子溅射技术、细胞冰冻蚀刻技术等样品制备方法，使学生能够学会运用电子显微镜技术对动植物组织细胞超微结构和功能的研究方法和技术手段。
二、电子显微镜技术在农学门类高等院校教学中的应用
1.电子显微镜技术在农学专业实验教学中的应用。透射电子显微镜可以观察植物细胞的细胞壁、生物膜、叶绿体、线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、微体、中心体、细胞骨架和细胞质内含物（如糖原、脂类、蛋白质），以及核膜、染色质、核仁的超微结构形态，通过对超微结构的学习和了解植物的生理代谢过程、病理变化机制，以及在外界因素的影响而导致形态结构和功能的改变[3，4]。为植物学、植物生理学、植物病学、植物生物学等学科学习奠定了理论基础，也为植物超微形态学的研究提供了技术手段。
2.电子显微镜技术在动物医学专业实验教学中的应用。在动物微生物学教学中，因病原微生物粒径微小，光学显微镜难以识别其特有结构，而通过TEM可以清晰地观察到细菌的特殊结构，如菌体鞭毛、菌毛、芽孢、荚膜等结构；病毒的囊膜、衣壳；霉病菌菌丝和孢子形态。通过电子显微镜的学习可以有助于学生对病原学的识别与理解，电子显微镜是病原学教学的有效工具[5]。
在动物病理学教学中，动物机体在致病因素作用下会导致细胞发生形态和功能上的改变，通过TME可以观察到病变区细胞的细胞器的损伤，对研究疾病的发生机制和致病机理和临床诊断提供有力的依据。例如，在肾活检、肿瘤诊治中电镜技术发挥了重要作用。电镜技术与免疫学技术相结合产生了免疫电镜技术，在超微结构和分子水平上研究各组织细胞的形态和功能，它可以对细胞表面及细胞内部的抗原进行定位，可以了解抗体合成过程中免疫球蛋白的分布情况、抗原—抗体复合物的结构细节以及免疫损伤引起细胞的病理变化[6]。
3.电子显微镜技术在动物科学专业实验教学中的应用。动物科学教学主要针对动物营养与饲养、饲料资源开发、饲料配方与饲料工艺设计，以及饲料与饲养企业管理等学科的研究，旨在满足人们日益增长的动物副食品饮食的需求。在动物科学的教学中将学习各种动物的养殖（包括养牛、养羊、养鹅、观赏动物饲养等），动物营养、遗传、繁殖、兽医学、牧草学、生态学、农业机械、农区规划、肉制品加工学等。在学习动物营养、遗传因素以及环境因素对动物生长发育的影响，可以通过电子显微镜观察动物组织细胞超微结构变化，来探讨和研究动物生长发育的特点，因此电子显微镜技术是动物科学教学和研究的重要技术手段。例如：应用扫描电镜检测鹿类毛的微观形态结构时可以明显观察到鹿毛的鳞片形态在科间、属间和种间存在的差异，同种不同个体毛的鳞片形态有差异，同一个体同一根毛样的不同部位也有差异[7]。
4.电子显微镜技术在食品与药品学专业实验教学中的应用。食品与药品学专业是以生命科学、食品科学和药品科学为基础，研究食品的营养、药品的安全与健康的关系，食品营养与安全保障、药品的安全与人类健康，通过对食品生产、加工的管理和控制，保证食品的营养品质和卫生质量，促进人体的健康。例如：荔枝的果实在采收后3～4天即开始变褐、变质、霉烂极不耐贮，通过用扫描电镜技术观察果皮结构，果皮的鲜红色是栅状组织细胞含大量花色甙所致，此花色甙流失，果皮即呈褐色。荔枝的外果皮仅有一层细胞外壁薄，角质层也薄，防止水分散失的能力差，果内的水分可部分地通过角质层散失到果外[8]。再如，运用扫描电镜对多种常见可食用淀粉颗粒的超微形貌进行观察，将考察的所有种类淀粉颗粒分为：块茎形、棒形、球形、扁平形、复粒结构、棱角圆滑和棱角尖锐多面体形及肾形等类别，通过扫描电子显微镜对淀粉颗粒超微形貌特征上加强国内淀粉产品的质量监管提供可靠参考[9]。
5.电子显微镜技术在园林专业实验教学中的应用。林学与园艺学专业是农业的重要组成部分，学习和掌握果树、蔬菜、花卉及观赏树木的栽培与繁育技术。园艺学科属于应用基础和应用型研究学科，是以农业生物学为主要理论基础，研究园艺作物生长发育和遗传规律的一门学科，也是研究园艺作物起源与分类、种质资源、遗传育种、栽培、病虫害防治及采后处理、贮藏加工等应用技术与原理的综合性学科。例如，观察五倍子乙醇提取物对表皮葡萄球菌的体外抗菌活性及其在电镜下菌细胞形态超微结构的变化时，采用新的中药抑菌实验方法对五倍子乙醇提取物进行表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度测定，用电镜观察用药后细菌细胞的形态改变。在电镜下观察经五倍子处理的表皮葡萄球菌细胞的超微结构，扫描电镜显示菌细胞形态大小不等，排列不整齐，大多数菌细胞的细胞壁破裂。在透射电镜下，菌细胞细胞壁结构、层次不请，胞浆膜层次不分明，细胞质内含物大多消失，细胞浆内包含体和染色体模糊不清[10]。再如，用扫描电镜对黑龙江产十种不同科属、不同生境的蕨类植物的孢子囊和叶表皮进行了详细观察，结果表明蕨类植物的孢子囊和叶表皮在扫描电镜下，显示出更为丰富的形态特征，并表现出细致而稳定的异同点，可作为蕨类系统分类的现代手段，能更好地应用于疑难科属的分类研究[11]。
6.电子显微镜技术在农业工程学专业实验教学中的应用。工程学是研究自然科学应用在各行业中的应用方式、方法的一门学科，同时也研究工程进行的一般规律，并进行改良研究。在农学专业中工程学专业主要包括水利科学专业、机械与交通专业、化学专业等学科。在工程学专业中建筑材料的质量与性质，对于工程建设至关重要。例如：对纳米材料特性的研究一般与粒径的大小分布及形状等微观结构有着重要的关系，扫描电子显微镜（SEM）和透射电镜（TEM）等，可以在极高的放大倍数下直接观察纳米颗粒的形貌和结构，特别是测量纳米颗粒的大小，既直观又非常方便，所以电子显微分析是研究纳米材料的一种重要手段，而其中透射电镜则是最常用的检测设备之一。透射电镜是基于传统电子束技术上发展起来的，它分辨率高、放大倍数高，分辨本领已达到了0.1～012nm，所得到的纳米图像直观清晰，可以揭示物质内部的微细结构，广泛应用于材料科学与生命科学领域，是研究纳米材料的常用重要分析仪器之一[12]。
三、展望
在农业技术快速发展的进程中，对农业人才专业素质的培养有了更高的要求。因而在教学过程中，就要使学生能够更扎实地掌握其专业基础知识和科学研究能力，在未来的农业科学的研究中，对样本显微和超微结构的研究也就越发深入，因而电子显微镜技术在农学专业的应用也越加广泛。因此，将电子显微镜技术应用于农业高等院校的科研和教学，使学生对动植物以及材料科学超微结构的认识有更加清晰地了解，为农业专业的人才培养和农业现代化发展提供技术保障，也可以为农业的发展提供重要的技术手段。
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一、脑细胞间液药理学的概念
自田代真一等[1]首次提出“血清药理学”的概念以来，逐渐形成了应用此种方法研究中药药理的趋势。但由于血脑屏障将大脑与外周严格区分，从而致使神经细胞的微观生存环境和屏障以外的其它体细胞有很大差别。首先，血清药物成分与能进入脑组织中的药物成分也存在较大差异。血脑屏障控制着物质的转运，保证中枢神经系统内环境的高度稳定。完整的血脑屏障是一个复杂的细胞系统，由血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞、神经元和细胞外基质共同构成，这一特殊结构可使血液中多种溶质从脑毛细血管选择性的进入脑组织。
其中，内皮细胞间的紧密连接、基底膜及星形胶质细胞的终足形成了BBB的3道机械屏障，而转运系统和药物代谢酶构成了其酶屏障。水溶性药物受到机械屏障的阻止，不能进入血脑屏障。脂溶性药物的跨膜转运受血脑屏障表面的多种转运体控制，转运体的表达受癫痫或炎症等因素影响，间接影响到脂溶性药物成分的透过率[2，3]。
其次，血清和脑细胞间液的基质物质不同。从该层意义上来讲，将含药血清用于神经元的培养并不恰当，已有实验证明含药血清对神经细胞有毒害作用[4]。所以，脑保护药物研究不适用血清药理学的方法，只能寻求其它手段。梅建勋等[4]提出脑脊液药理学的概念，采用正常家兔给予受试中药，然后从小脑延髓池穿刺采集脑脊液，用于神经细胞培养。结果显示，含药脑脊液有一定的神经营养作用。由于脑脊液与脑细胞间液存在交换，研究脑脊液中化学物质的变化，一定程度上可以反应血脑屏障通透性的变化[5]，但不同药物在脑脊液与脑细胞间液中的药物浓度存在差距。LiuX等[6]分别采用微透析法和抽取脑脊液的方法，检测了戊硫代巴比妥、9-羟利培酮等9种药物在脑细胞间液和脑脊液中的含量，结果9-羟利培酮在脑脊液中的浓度是微透析液浓度的5倍，其余8种药物脑脊液中浓度均在微透析液浓度的3倍以内，证明脑脊液中药物成分也有异于脑细胞间液。血-脑脊液屏障位于脑室脉络丛的血液与脑脊液之间，其结构基础主要是脉络丛上皮细胞之间有闭锁小带相连，与血-脑屏障相比结构疏松，存在渗漏的小孔，故脑脊液与血液间存在丰富的物质交换。进入脑脊液的小分子示踪剂按时间顺序依次在血管、毛细血管、引流静脉和脑细胞间液中被检出，这证明脑脊液与脑细胞间液的交换相比血液与脑脊液的交换更慢，这是因为脑脊液中的成分要进入脑组织间隙需要通过紧密连接，相比之下交换较为困难[5]。
基于上述研究，本课题组提出脑细胞间液药理学的研究思路。实验动物口服或静脉给药后，采用含有药物成分的脑细胞间液，研究对细胞或组织等模型的药效和作用机制，即脑细胞间液药理学。脑细胞间液是神经细胞生存的直接外环境，也是药物成分透过血脑屏障作用于神经细胞的必经途径，故脑细胞间液是检测透过血脑屏障药物成分的最佳载体。参照血清药理学，检测脑细胞间液中药物成分，并以其作为干预因素进行体外实验是脑细胞间液药理学的主要内涵。
二、建立脑细胞间液药理学的关键技术
微透析（Microdialysis）是灌流采样与透析相结合的新型生物采样技术，诞生于20世纪70年代，最早用来测定脑内神经递质的含量。因微透析具有活体微创、可动态观察、采样量小的特点，在生命科学研究中应用越来越广泛。尤其在能透过血脑屏障药物的药代动力学、生物利用度等研究中，微透析技术成为不可或缺的手段之一[7]。微透析技术用于脑细胞间液药理学的优点如下：①微透析可以用于实验动物的活体采样，且对动物的伤害较小，属于微创手术。在采样过程中可以保持小型动物（大鼠、小鼠）清醒活动状态，收集的数据能较为真实地反映动物的活体生物指标，不受大面积创伤、麻醉等激烈刺激的影响；②微透析样品可以实时反映透析液中待测物的变化情况，以浓度为纵坐标，时间为横坐标描绘待测物的量-时曲线，可以直观地反映待测物含量的变化趋势。若是微量样品以微柱测定，时间间隔甚至可以缩短到3min，避免待测物因降解所造成的测定不准确；③样品中无大分子物质，基本不需处理可直接分析。由于微透析样品经对大分子无通透性的半透膜透析得来，蛋白质等大分子都被截留膜外（可透过分子量约为5000~50000Da），样品可以直接由液相色谱、质谱等精密仪器分析，省时高效，避免样品处理过程中损耗、引入其它杂质所造成的数据偏差；④脑微透析液可直接反映脑细胞间液中的药物水平，在透析取样过程中，由于与蛋白结合的药物不能穿过半透膜，所以微透析样品中所得的游离型药物浓度更能体现与药理作用的相关性；⑤微透析液是与神经细胞外环境组成高度相似的基质，从药物或内源性成分的组成都适用于神经细胞的体外实验。因此，微透析技术为脑细胞间液药理学提供了技术保障。
三、脑细胞间液药理学用于中药复方研究的优势
1.有助于中药复方有效成分的靶向性筛选
中药复方是中医临床用药的主要形式，体现了中医药的特色与优势，同时，中药复方的研究也充满了复杂性，其作用规律及作用机制研究引起世界学者的兴趣[8]。本课题组认为，对中药复方有效成分的研究必须与其特定功效紧密结合，具体问题具体分析[9]。我国学者王喜军等进行了大量的血清药物化学的实践研究工作，他从血清中分离、鉴定移行成分，研究血清中移行成分与传统疗效的相关性。中药归经学说认为，药物的功效与其归经密切相关。受上述启发，我们认为复方的有效成分也应与其代谢分布密切相关。靶向性筛选有助于研究中药复方有效成分，即通过研究靶器官的药物蓄积、代谢情况，为阐述药物有效成分提供依据。针对脑血管疾病治疗过程中的血脑屏障难题，药物透过血脑屏障的靶向性研究是筛选脑保护中药的重要途径。虽然有研究表明中药可通过作用于内皮细胞间接干预脑实质的病理变化[10]，但通过血脑屏障，直接作用于脑实质是脑保护药物的主要作用途径[11，12]。对治疗脑部疾病的中药化学组分进行靶向性筛选，检测通过血脑屏障进入脑实质中的药物组分，有助于发现中药的脑保护物质基础。如本课题组研究了由3味中药组成的复方塞络通胶囊（原：维脑康），给药后大鼠脑微透析液中的药物成分来源于其中两味中药的3种成分。
2.有利于动态观察脑内药理指标的变化
脑缺血等疾病发生后，脑细胞间液中兴奋性氨基酸、单胺类神经递质和乙酰胆碱等内源性物质含量发生变化，反映了疾病进程和病变机制。对脑细胞间液中上述内源性生物活性物质的检测，是研究脑病发病机制和治疗药物的重要手段。如通过采用微透析技术研究脑细胞间液中兴奋性氨基酸的含量，发现兴奋性氨基酸异常释放是脑缺血后的关键病理环节[13]，且一些治疗药物对此有抑制作用[14，15]。
另外，儿茶酚胺类神经递质（DA和NE）、5-HT及乙酰胆碱的释放增加与很多脑病发病机制相关[16，17]。基于微透析技术，检测上述神经递质在脑细胞间液中的含量变化可以动态、连续的反映其病理变化。
3.有利于体外研究中药复方的作用机制
因脑细胞间液是神经细胞的真实生存环境，采用微透析技术采集的样品是脑细胞间液的稀释液，故微透析液体外培养神经细胞理论上存在可能。本课题组对MCAO大鼠给予复方中药治疗，收集脑微透析液进行体外药理实验。前期研究表明，采用含40%正常脑细胞间液的培养液，对正常和受损神经元的生存率和LDH释放率均无显著干预作用，而加入同样浓度的含药脑细胞间液，对受损神经元有显著保护作用[18]。采用含药微透析液，相比直接采用药物或药物有效成分进行体外细胞实验，具有如下优点：①中药复方制剂多为汤剂、胶囊、丸剂等，在加入培养液前的溶解、过滤等环节均存在较大困难，而微透析液中多为小分子物质，仅过滤除菌即可应用，其成分不会发生改变；②微透析液中的药物成分是复方经吸收、代谢、透过血脑屏障后到达作用部位的实际状态，更接近药物在临床中的应用；③中药复方有可能作用于神经元外的其它细胞而发挥作用，如促进星型胶质细胞分泌神经营养因子，而脑细胞间液体现了给药后脑内的内源性分子改变，所以可更全面体现复方的脑保护功效。
4.反映病理状态下血脑屏障透过率的改变
在血清药理学研究中，人们注意到中药复方进入生理状态下的动物机体与进入病理状态的动物机体，其体内过程是不一致的[19]。在病理状态下，药物通过血脑屏障的透过率也不同于生理状态。脑缺血引起炎症反应、蛋白酶激活、氧自由基产生等一系列的病理变化，会导致紧密连接的破坏和血脑屏障通透性的增加，有些药物较生理状态时更容易进入血脑屏障[2]，如银杏内酯B在缺血侧半脑的药物浓度显著高于健侧[20]。但有些药物与之相反，如Spudich等[21]发现在局灶性脑缺血发生后，脑毛细血管内皮细胞的抗药转运体Mdr-1表达明显上调，造成某些药物透过血脑屏障明显受阻。所以，脑缺血中风治疗药物的靶向性研究应在其相应病理模型上进行。另外，给药剂量也应按临床正常用量进行人与动物给药剂量换算，既与临床用药规范相符合，又不会改变药物代谢及与机体间的相互作用[1]。
四、脑细胞间液药理学尚须解决的问题