关键词红薯；地福来活性细胞生物肥；肥效
中图分类号S531文献标识码A文章编号1007-5739（2016）09-0010-01
为了验证“地福来”藻类活性细胞生物肥在红薯上的使用效果，特于2015年6―10月开展了此试验，现将研究结果总结如下。
1材料与方法
1.1试验地概况
2015年6月18日至10月13日，在明光市自来桥镇乌山村某农户家田块安排北京地福来藻类活性细胞生物肥红薯试验。供试土壤为黄棕壤土类，黄棕壤亚类，暗石黄棕土土属，厚层暗石土土种，耕层厚度18cm，地下水位120cm，养分含量为有机质11.7g/kg，pH值6.8，全氮0.77g/kg，有效磷18.2mg/kg，速效钾129mg/kg。
1.2供试材料
供试肥料：45%测土配方肥（13-15-17），产地明光嘉丰肥业；北京地福来藻类活性细胞生物肥，由北京地福来科技发展有限公司生产提供。试验作物红薯，品种为徐薯32，在自来桥镇常年产量30t/hm2。
1.3试验设计
试验设3个处理，分别为处理1：常规施肥+苗期地福来藻类活性细胞生物肥4500mL/hm2；CK1：常规施肥+苗期地福来藻类活性细胞生物肥（基质）4500mL/hm2；CK2：常规施肥。常规施肥用45%测土配方肥（13-15-17）750kg/hm2，氮、磷、钾纯养分分别为97.5、112.5、127.5kg/hm2。3次重复，随机排列。小区面积均为40m2（5m×8m）。
1.4试验方法
试验区施用肥料，全部作基肥一次性深施，无追肥[1]；地福来藻类活性细胞生物肥4500mL/hm2，对水200倍在红薯移栽时沾根，基质是指采用高压高温将地福来藻类活性细胞生物肥进行灭活作对照（可用高压灭菌锅121℃0.5MPa30min，或将产品装入加盖容器中，隔水放入蒸锅中沸水蒸煮40min灭活），用量方法同CK1[2-3]。
2015年6月17日整地、施肥、起垄，做小区，每小区5垄，每垄长8m，垄宽0.9m，18日人工栽插，每小区栽195株，密度48750株/hm2，7月12日化学除草，田间管理等农事正常进行[4-6]，10月13日收获。
2结果与分析
2.1生物学性状分析
3个不同处理生育期无明显差异，外观叶色以处理1在薯蔓伸长期叶色较浓绿，生长旺盛。中后期各处理外观无明显差异。
2.2商品性分析
经实收商品性检测，处理1甘薯茎叶及薯块产量均比CK1、CK2高，其中薯块重量大于100g以上的商品率为91.3%，比CK1、CK2分别高4.0、4.1个百分点，而且薯形皮色均较好，CK1与CK2间差异不明显（表1）。
2.3产量分析
经实收产量结果：处理1产量最高，达41662.5kg/hm2，CK1产量为39625.0kg/hm2，CK2为38325.0kg/hm2，处理1比CK1增产2037.5kg/hm2，增幅为5.14%，比CK2增产3337.5kg/hm2，增幅8.71%；CK1比CK2增产1300kg/hm2，增幅3.39%（表1）。
2.4生物统计方差分析
经生物统计方差分析：处理间F值=65.962>F0.05（6.944），重复间F值=0.428
2.5经济效益分析
各种肥料价格：甘薯配方肥2600元/t、成本为1950元/hm2，地福来细胞肥10万元/t，用量4500mL/hm2价格为（下转第13页）
（上接第10页）
450元/hm2，甘薯价格0.8元/kg计算。不同处理的产量、产值（产量×单价）、肥料成本（肥料数量×单价+追肥成本）、纯收入（产值-肥料成本）、投产比（纯收入与肥料成本比值）等指标见表3。从纯收益来看，处理1的产值为33330元/hm2，扣除肥料及地福来细胞肥2400元/hm2，纯效益为30930元/hm2，排第1位；CK2产值为31700元/hm2，扣除肥料及基质2400元/hm2，纯效益为29300元/hm2，排第2位；CK2产值为30660元/hm2，扣除肥料成本1950元/hm2，纯效益为28710元/hm2，排第3位。处理1比CK1增效1630元/hm2，增幅5.56%；比CK3增效2220元/hm2，增幅7.73%；CK1比CK2增效590元/hm2，增幅2.06%。投入产出比以CK3最高，为14.72，处理1比CK1高0.68。
3结论
试验结果表明，使用地福来红薯细胞肥可以增强甘薯抗性，长势较好，叶色较浓，可以提高甘薯商品性，甘薯薯形皮色均较好，100g以上薯块商品率为91.3%，比基质对照提高4.0个百分点。使用地福来红薯细胞肥可以提高甘薯产量。比基质对照增产2037.5kg/hm2，增幅为5.14%，比常规施肥对照增产3337.5kg/hm2，增幅8.71%，增产效果极显著。使用地福来红薯细胞肥可以提高甘薯经济效益，比基质对照增效1630元/hm2，增幅5.56%；比常规施肥对照增效2220元/hm2，增幅7.73%，产投比高0.68。
4参考文献
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【摘要】目的探索研究水溶性维生素（维生素B1、维生素B6、维生素B12和维生素C）对体外小鼠淋巴细胞活化的作用。方法采用改良的MTT法，来检测体外小鼠淋巴细胞活性。结果VitB1100μl(含0.005μg)、VitB6（12.5μl含0.000625μg）对体外小鼠淋巴细胞活性是明显的，VitC25μl(含0.01μg)作用也是明显的。VitB12则随浓度增高作用稍有增强，但差异无显著性。结论结果显示VitB1、VitB6和VitC对小鼠淋巴细胞活性有增强作用。
【关键词】水溶性维生素；MTT法；小鼠淋巴细胞
【Abstract】ObjectiveWeproposedtostudytheeffecteofwatersoluleVitamins(VitaminB1、Vitamin6、Vitamin12andVitaminC)invitromicelymphocytes.MethodsWetookthemodifiedmethodofMTTtoexplosetheactivationorinvitromicelymphocytes.ResultsVitB1100μl(contain0.005μg)、VitB6（12.5μlcontain0.000625μg）、stimualatedtheeffectofinvitromicelymphocyteswhichwasobviousandVitaminC（25μlcontain0.01μg)）wasmanifestedtoo.ConclusionWatersoluleVitamins(VitB1、VitB6、VitB12andVitC)wereabletostimulatetheativationofinvitromicelymphocytesundercerftainconcentration.
【Keywords】watersobalevitamin；MTTmethod；
micelymphocytes
水溶性维生素包括B族维生素和维生素C，是维持人体正常生理机能和物质的能量代谢所必需的物质。当前许多国内外学者研究它们抗衰老、抗氧化和对胸腺的作用，企图阐明它们对机体免疫功能的作用。许多学者都涉及它们提高机体免疫力，但未见报道它们直接对淋巴细胞的作用。本文选用和人类基因组具有大量同源性小鼠的淋巴细胞，体外实验检测维生素B1、B6、B12和维生素C对小鼠血中淋巴细胞活性的作用。
Mosman(1983)［1］报道噻唑蓝（MTT）比色法，经后人改良，使这种方法更加完善，成为定量、重复性好、简便易行的检测淋巴细胞活性的好方法。我们采用此法，现将结果报告如下。
1材料与方法
1.1实验动物和主要试剂及实验仪器ICR小鼠，体重（20±2）g，雄性，由首都医科大学实验动物部提供。RPM1640培养液为Hyclone公司产品，噻唑蓝（MTT）为Sigma公司产品，10%十二烷基磺酸钠（SDS）为BRL公司产品，淋巴细胞分离液为TBD生物技术发展中心产品，维生素B1（5mg/ml）、B6（5mg/ml）、B12（0.5mg/ml）均为天津金耀氨基酸有限公司产品，维生素C（400mg/ml）为北京双鹤药业有限公司产品，酶标仪为SLT公司产品（型号为A-5082）。
1.2方法(1)淋巴细胞的分离，从ICR小鼠(雄性)眼静脉采血，加入等量细胞分离液，低速离心，吸取淋巴细胞层，洗3次，立即进行淋巴细胞计数，4℃保存在RPM1640培养液中待用。(2)噻唑蓝比色法，将制备的活的小鼠淋巴细胞分管，分别设实验管（孔）6管（孔），对照管6管（孔）。①VitB1实验组，每6管（孔）分别加入VitB1400μl(含0.02μg)（6孔）、200μl(含0.01μg)（6孔）、100μl(含0.005μg)（6孔），对照组每孔加入等体积的RPM1640液（6孔）。②VitB6实验组，每6管（孔）分别加入VitB650μl(含0.0025μg)（6孔）、25μl(含0.00125μg)（6孔）、12.5μl(含0.000625μg)（6孔），对照组每孔加入等体积(含的RPM1640液（6孔）。③VitB12实验组，每6管（孔）分别加入VitB12400μl(含0.0002μg)（6孔）、200μl(含0.0001μg)（6孔）、100μl(含0.00005μg)（6孔），对照组每孔加入等体积的RPM1640液（6孔）。④VitC实验组，每6管（孔）分别加入VitB6100μl(含0.04μg)（6孔）、50μl(含0.02μg)（6孔）、25μl(含0.01μg)（6孔），对照组每孔加入等体积的RPM1640液（6孔）。37℃温育2h后，每管（孔）加入20μlMTT（5mg/mlMTT溶于PBSpH7.5），轻轻震荡后，37℃温育2h后，每管加10%SDS（溶于双蒸水），轻轻震荡，待甲簪颗粒完全释放，酶标仪测OD570值。
2结果
2.1VitB1对小鼠淋巴细胞活性的作用VitB1对小鼠淋巴细胞活性的作用，随浓度增加，作用减弱，当VitB1100μl(含0.005μg)对小鼠淋巴细胞活化作用有显著增强作用，P
2.2VitB6对小鼠淋巴细胞活性的作用VitB6对小鼠淋巴细胞活性的作用，随浓度增加，作用减弱，当浓度为12.5μl(含0.000625μg)稍有增强作用（见图2）。
2.3VitB12对小鼠淋巴细胞活性的作用VitB12对小鼠淋巴细胞活性的作用，随浓度增高作用稍有增强作用，但不明显（见图3）。
2.4VitC对小鼠淋巴细胞活性的作用VitC对小鼠淋巴细胞活性的作用，随浓度升高，作用减弱，当浓度为25μl(含0.01μg)作用最强，P
Mosman(1983年)报道噻唑蓝（MTT）比色法测定细胞的活性。MTT可被各种类型的活细胞（RBC除外）摄取，活性强的细胞摄取较多的MTT，在线粒体内被脱氢酶还原为甲簪(Formazan)，颜色由黄变深紫，加入SDS使细胞完全裂解，在波长570nm下酶标仪测量OD值，OD值越高，反应细胞活性越强［2，3］。因此，MTT法可定量测量细胞活性。此方法，经后人改良，更加完善，成为定量好、重复性好、简便易行的好方法。我们采用小鼠静脉血，分离出淋巴细胞。淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞，其中T细胞占70%左右。因此，我们测量的小鼠淋巴细胞活性，充分反应T淋巴细胞活性。结果显示，VitB1（100μl含0.005μg），VitB6(12.5μl含0.000625μg)对小鼠淋巴细胞活性有显著增强作用。VitC在25μl（含0.01μg）、50μl（含0.02μg）、100μl(含0.04μg)均有显著增强小鼠淋巴细胞活性的作用，但随着VitC浓度增加，作用有稍减的趋势，但VitB12增强小鼠淋巴细胞活性不明显。VitB1、VitB6、VitB12均涉及体内的细胞正常生理生化功能，因此，它们也参与小鼠淋巴细胞生理、生化功能［4］。VitC维持细胞酶的活性，当然也影响淋巴细胞酶的活性，有报道VitC在淋巴细胞中浓度较高，当应激和感染时，淋巴细胞中VitC浓度降低。还有报道，VitC有增强NK细胞的活性，因此增强机体抗肿瘤的作用［5，6］。
国内许多学者均提到VitB1、VitB6、VitB12和VitC等水溶性维生素有增强固有免疫和适应免疫的功能。但至今未见报道它们直接对动物淋巴细胞活性增强作用的研究报道。本文初步阐明VitB1、VitB6VitB12和VitC在体外对小鼠淋巴细胞活性有增强作用。这结果是否反应它们有对人的淋巴细胞活性增强作用，尚待再进一步研究。至于水溶性维生素不同浓度作用不同，体外实验受到pH值的影响。
1MosmannT.RepidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvirvalApplicationtoproliferationandcytotoxicityassays.JImmunolMeth，1983，65：55-63.
2陈哲生.噻唑蓝比色法检测细胞的活性.上海医学检验杂志，1994，9（4）：205-206.
3陈哲生.噻唑蓝比色法用来研究人类淋巴细胞和小鼠巨噬细胞的活性.上海免疫学杂志，1992，12(5)：269-317.
4荫士安，汪之琐.现代营养学.第八版.第4篇.水溶性维生素.北京：化学工业出版社，2004，213-285.
关键词：小学生；音乐；美
一、走进“动物世界”，引导学生表演，体验情感美
音乐是声音的艺术，音乐影响情感的方式很特殊，无论是欢快的音乐还是悲伤的音乐，学生在音乐的感召下是喜欢“脖子扭扭，屁股扭扭”的。在潜移默化中对学生进行情感教育，他们的情感世界会变得丰富起来。课堂上通过表演音乐作品的艺术形象来感染学生，可以引导学生体验歌曲的情感美。
例如，儿童歌曲《大鹿》是一首旋律明快、节奏简洁的法国歌曲，根据教材内容及学生特点，我在学习歌曲时首先让学生反复聆听音乐旋律，要求学生跟着音乐放开手脚，把自己想象的各种小动物用身体动作表演出来，然后播放歌曲进行聆听。有的学生在听到歌曲内容后争先恐后表演开了：有的表演成惊慌失措的小兔，在使劲敲门；有的表演了胸有成竹的猎人，望着“小兔”在笑；有的把自己演成勇敢坚定的大鹿，手挽着“小兔”，时刻准备抵挡猎人的入侵。就这样，不同表演风格的音乐剧在孩子们的欢歌笑语中一一上演。手舞之，脚踏之，嘴唱之，调动了学生身体的各个器官，使其主动参与音乐表演的活动。学生通过自己聆听旋律，学习歌曲，根据音乐的节奏、旋律、内容表演了不同的角色，教师在潜移默化中引导他们了解大鹿和小兔是靠着团结的力量战胜了猎人，那么同学之间也应该互相帮助，克服学习和生活中的困难。
二、走进“春天”，引导学生绘画，理解歌词美
音乐课堂教学以音乐教学为主线和其他学科进行联系和沟通。音乐和绘画是姐妹，如果将绘画引入课堂，引导学生进行绘画，可以更加形象地理解美丽的歌词。
例如，歌曲《春雨蒙蒙地下》描绘了春天的小雨淅淅沥沥，表现人们由衷地赞美春雨，对春天充满了希望和遐想。在教学这首歌时，一开始我没有讲春天的景象，而是出示事先准备好的一幅没有色彩的图画，画中有小溪、小鱼、小草、小鸭……我要求学生发挥想象力，带着“小雨点”（画笔）去寻找“春天”“雨点”落到哪里，哪里就涂上合适的颜色。于是小草碧绿，桃花粉红，小溪清清，鹅黄的小鸭和金色的小鲤鱼在追逐嬉戏……好一幅春意盎然的美景，“学科综合”丰富了音乐学科的人文蕴含，提高了学生综合能力和个性的和谐发展，学生不仅用自己的画笔表现了美丽的春天，从视觉上感受春天的景象，而且在绘画中理解了歌词的美，开心地听唱春天的歌曲，融入了生机勃勃的春意中，表达了对大自然的赞美与热爱。
三、走进“花名”，引导学生创编，感受节奏美
《义务教育音乐课程标准》指出：创造教学是引导学生发挥想象力，发掘创造性思维潜能的音乐学习领域，是引导学生积累创作经验的重要学习领域。鼓励音乐创造的目的在于通过音乐的形象思维，应引导学生从生活体验入手，开发学生的创编才能，从而感受节奏美。
例如，低年级学生学完《打花巴掌》这课时，我鼓励学生结合学过的知识，根据生活经验把喜爱的花名首先进行有节奏地念词，然后编成新的歌词进行演唱，学生积极性很高，我同时开设了“我是小小词作家”栏目，并进行点评和奖励。实践证明学生是完全有兴趣、有能力参与和进行歌词创作练习的。而且出乎意料的是，由于部分音乐天赋较好、语言词汇运用能力较强的小学生在学习过程中起到了积极的带头作用，使得本来预计要八分钟左右时间完成的教学内容在短短的四分钟时间内就得以完成。传统的教学固然存在着一些弊端，但它在教学中的很多作用是其他教学模式所不能替代的。为了开展创编课教学，特别是歌词的创编，也必须在传统课的教学过程中进行一些有关的知识学习。创编歌词教学的目的不是培养词作家，学会作词也并非是教学的最终目的。开展此类创编教学旨在提升学生对音乐的兴趣以及发挥学生的想象力、发展学生基本的音乐素质。更进一步的要求，是在此类创编性的学习过程中培养学生的创新素质，从而更好地适应当今课改的发展需求。
湖南省长沙市第三医院老年医学科，湖南长沙410005
[摘要]目的探讨乌司他丁对呼吸机相关性肺损伤老年患者细胞因子及生活质量的影响。方法选取呼吸机相关性肺损伤老年患者90例，以随机数字表法分为对照组（45例）和乌司他丁组（45例）；对照组患者给予常规对症支持治疗；乌司他丁组患者则在此基础上加用乌司他丁微量泵入治疗；比较两组患者治疗前后血清细胞因子水平和圣乔治呼吸问卷评分等。结果对照组患者治疗后TNF-α，IL-6及IL-8指标分别为（283.61±78.13）、（135.16±58.33）、（103.81±56.13）pg/mL；乌司他丁组患者治疗后TNF-α，IL-6及IL-8指标分别为（159.24±52.47）、（73.49±30.67）、（73.14±48.80）pg/mL；两组患者治疗后血清细胞因子水平和圣乔治呼吸问卷评分均显著优于治疗前，且乌司他丁组患者治疗后改善程度优于对照组(P<0.05)。结论乌司他丁对呼吸机相关性肺损伤老年患者可有效减低机体炎症水平，提高生活质量。
[
关键词]乌司他丁；呼吸机；肺损伤；细胞因子；生活质量
[中图分类号]R563
[文献标识码]A
[文章编号]1672-5654（2014）11（a）-0016-02
EffectsofUlinastatinonCellFactorandQualityofLifeofElderlyPatientswithVentilatorInducedLungInjury
LIAOHaiyingYIHongyu
ChangshaCityhunanprovincethirdhospitalofgeriatrics,Hunan410005,China
[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectsofulinastatinoncellfactorandqualityoflifeofelderlypatientswithventilatorinducedlunginjury.Methods90elderlypatientswithventilatorinducedlunginjurywerechosenandrandomlydividedintobothgroupincludingcontrolgroup(45patients)withconventionalsymptomatictreatmentandulinastatingroup(45patients)withulinastatintreatmentonthebasisofcontrolgroup;andtheserumlevelsofcytokinesandscoresofSt.George´sRespiratoryQuestionnaireofbothgroupswerecompared.ResultsTheserumlevelsofTNF-α,IL-6andIL-8ofcontrolgroupaftertreatmentwereseparately（283.61±78.13）、（135.16±58.33）、（103.81±56.13）pg/mL;TheserumlevelsofTNF-α,IL-6andIL-8ofulinastatingroupaftertreatmentwereseparately（159.24±52.47）、（73.49±30.67）、（73.14±48.80）pg/mL;TheserumlevelsofcytokinesandscoresofSt.George´sRespiratoryQuestionnaireaftertreatmentofbothgroupswassignificantlybetterthanbeforetreatment（P<0.05）.TheserumlevelsofcytokinesandscoresofSt.George´sRespiratoryQuestionnaireaftertreatmentofulinastatingroupwassignificantlybetterthancontrolgroup（P<0.05）.ConclusionUlinastatinintreatmentofelderlypatientswithventilatorinducedlunginjurycanefficientlyreduceinflammatorylevelandimprovequalityoflife.
[Keywords]Ulinastatin；Ventilator；Lunginjury；Cellfactor；Qualityoflife
作为机械通气常见并发症类型之一，呼吸机相关性肺损伤(VILI)可导致呼吸功能下降，严重降低生活质量，并威胁生命安全[1-2]。近年来研究显示，呼吸机机械诱发激活机体炎性细胞激活和炎症介质表达曾是导致肺损伤发生的关键机制[3-4]。本次研究选取呼吸机相关性肺损伤老年患者90例，分别给予常规对症支持和在此基础上加用乌司他丁微量泵入治疗，比较两组患者治疗前后血清细胞因子水平和圣乔治呼吸问卷评分等，探讨乌司他丁对呼吸机相关性肺损伤老年患者细胞因子及生活质量的影响。
1资料与方法
1.1一般资料
选取我院2010年1月—2013年12月收治呼吸机相关性肺损伤老年患者90例，均符合《急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征诊断和治疗指南(2006)》诊断标准[5]，基础疾病均为COPD并发呼吸衰竭排除标准：颅脑损伤及严重肝肾功能障碍者。入选患者以随机数字表法分为对照组（45例）和乌司他丁组（45例）。对照组患者中男性31例，女性14例，年龄61~78岁，平均年龄为（65.30±5.87）岁；乌司他丁组组患者中男性30例，女性15例，年龄62~80岁，平均年龄为（65.56±5.90）岁；两组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2治疗方法
对照组患者给予常规对症支持治疗，包括吸氧，早期抗感染及营养支持等；乌司他丁组患者则在此基础上加用乌司他丁微量泵入治疗，5万U/kg溶于5%葡萄糖注射液500mL1次／d，连续用药3d。
1.3观察指标
①分别于治疗前后行血清细胞因子水平检测，包括TNF-α，IL-6及IL-8，检测方法为抗体夹心酶标免疫法(ELlSA法)；②生活质量评价采用圣乔治呼吸问卷(George’Srespiratoryquestionnaire，SGRQ)[6]，包括症状、活动及影响评分3部分。
1.4统计学分析
数据录入处理采用Epidata3.01和spss17.0软件；计量资料和计数资料分别选择t检验和χ2检验；P<0.05判定为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组患者治疗前后血清细胞因子水平比较
两组患者治疗后血清细胞因子水平均显著低于治疗前，且乌司他丁组患者治疗后下降程度优于对照组(P<0.05)；见表1。
2.2两组患者治疗前后圣乔治呼吸问卷评分比较
两组患者治疗后圣乔治呼吸问卷评分显著高于治疗前，且乌司他丁组患者治疗后提高程度优于对照组(P<0.05)；见表2。
3讨论
目前认为呼吸机机械通气时异常作用力在肺泡隔及肺泡上皮细胞形成刺激，诱发炎症细胞因子及其他炎性介质水平上升，进而导致炎症级联“瀑布反应”出现[7-9]，最终导致肺组织损伤。动物实验证实，机械通气大鼠肺部TNF-α水平升高明显，可引起粒细胞、上皮细胞生成IL-8能力增加，上调IL-8水平，加重肺泡毛细血管内皮细胞损伤及肺水肿[10-11]；而其诱发巨噬细胞释放IL-6作用亦被证实[12]。
本次研究结果中，对照组患者治疗后TNF-α，IL-6及IL-8指标分别为（283.61±78.13）、（135.16±58.33）、（103.81±56.13）pg/mL；乌司他丁组患者治疗后TNF-α，IL-6及IL-8指标分别为（159.24±52.47）、（73.49±30.67）、（73.14±48.80）pg/mL；两组患者治疗后血清细胞因子水平和圣乔治呼吸问卷评分均显著优于治疗前，且乌司他丁组患者治疗后两项指标改善程度优于对照组(P<0.05)，提示相较于单纯对症支持治疗，乌司他丁辅助治疗老年呼吸机相关性肺损伤在清除机体炎症细胞因子和提高呼吸功能方面具有优势。乌司他丁是一种新型胰蛋白酶抑制剂，多项动物和临床试验显示，其具有肿瘤坏死因子-α和白介素-8高效释放抑制作用，并能拮抗中性粒细胞蛋白酶释放，在改善局部微循环和提高组织灌注水平方面作用确切等进，可用于全身炎性反应与代偿性抗炎反应平衡调节[13-14]；同时笔者认为肺部炎症反应水平降低和血流灌注增加是导致老年呼吸机相关性肺损伤患者应用乌司他丁后肺功能改善的主要机制，还有待进一步实验研究探讨。
综上所述，乌司他丁对呼吸机相关性肺损伤老年患者可有效减低机体炎症水平，提高生活质量。但鉴于研究样本量小，随访时间短等因素限制，所得结论还需更大规模临床试验证实。
[
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反应性或免疫反应性低的特点，跨物种应用不会引起免疫排斥反应；3）VEGF和MSC联合应用具有协同作用，可在短期内重建缺血区域的血液循环，解决超比例皮瓣的远蒂端缺血问题，提高皮瓣成活率和创面组织的修复质量。
[关键词]血管内皮生长因子；骨髓间充质干细胞；皮瓣
[中图分类号]R782.2[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.020
血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowth
factor，VEGF）是一种可被大多数细胞分泌的糖蛋白二聚体分子[1]，相对分子质量为3.4×104～4.5×104，可通过生成细胞间隙而增加内皮细胞的通透性。VEGF也是主要的低氧诱导性血管生成因子[2]，可通过自分
泌和旁分泌作用，刺激血管内皮细胞有丝分裂并增加血管内皮细胞的渗透性以促进血管生成，进而起到促进组织愈合的作用。骨髓间充质干细胞（bone
marrowmesenchymalstemcell，MSC）是存在于骨髓中的具有多种分化潜能的干细胞，增殖迅速，并具有低免疫原性的特点，能在特定的条件下向所有起源于中胚层的细胞分化。本研究根据VEGF和人MSC的生物学特性，将二者联合应用，观察二者对超比例随意皮瓣成活率的影响。
1材料和方法
1.1MSC的分离、培养和鉴定
无菌条件下取人骨髓血2～5mL，与等量L-DMEM培养液混合，1000r·min-1离心8min使细胞形成微团。弃去上清及脂肪层，再用L-DMEM培养液重悬细胞，以等体积比轻轻叠加在分离液Percoll（质量浓度1.073g·mL-1）的液面上，2500r·min-1离心30min。离心后，抽取培养液与分离液液面之间的单个核细胞层，加入L-DMEM培养液冲洗，1200r·min-1离心8min，再用含10%胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞并计数，以每毫升3×106～4×106个细胞的密度接种在24孔板中，37℃、5%CO2全湿度条件下培养24～48h，换液去除未贴壁的悬浮细胞，继续培养，每隔3～4d换液1次。待原代培养细胞接近汇合（汇合度大于80%）时，弃去培养液，加入胰酶消化细胞。当细胞体收缩间隙变大，加入含10%胎牛血清培养液终止消化，吸取细胞悬液离心洗涤，800r·min-1离心
8min，培养液重悬细胞，以1∶3比例扩增培养，此为第1代细胞。以相同方法培养细胞并传代，依次为第2、3代，直至第12代。分别取第3、4代细胞，采用流式细胞术检测其表面标志。
取3代以上细胞行成脂、成骨诱导，鉴定培养的MSC的生物学特性。成脂诱导方法：将细胞按每孔1×105个细胞接种于六孔板，标准培养液培养24h后换用含10%胎牛血清的DMEM培养液，并加入地塞米松1μmol·L-1、吲哚美辛200μmol·L-1、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）
0.5mmol·L-1、胰岛素10μg·mL-1，每3d半量换液，共诱导2周；诱导后弃去培养液用PBS洗1遍，加入12%中性甲醛溶液固定5min，加入油红O染液染色30min，60%甲醛脱色数秒。成骨诱导方法：将细胞以每毫升1×106个细胞的密度接种于24孔板内，待细胞达70%汇合时，换条件培养液（含地塞米松10mmol·L-1、维生素C2×104mmol·L-1、磷酸甘油钠10mmol·L-1）进行诱导培养，以后每隔3d更换培养液1次，诱导28d后将细胞固定；用蒸馏水洗盖玻片，滴加1%硝酸银溶液置于强光下作用15～60min，蒸馏水洗3min，2%硫
代硫酸钠溶液处理2min，流水冲洗5min，常规封片。
1.2VEGF溶液的配制
采用通过大肠杆菌培养的重组大鼠VEGF165
（Sigma公司，美国）配制VEGF溶液。VEGF165质量浓度为1.0～5.0ng·mL-1时，以人脐带静脉内皮细胞增殖的计量依赖性刺激为标准，用蒸馏水重新配制VEGF，使其质量浓度达到1.0g·L-1。将溶液再稀释到蒸馏水中，形成0.5g·L-1的VEGF作用液。
1.3实验动物和分组
取40只Wistar大鼠（吉林大学动物实验中心提供）进行实验。大鼠体重（200±20）g，雌雄不限，随机
分成A、B、C、D共4组，每组10只。A组为空白对照组，B组为VEGF组，C组为MSC组，D组为MSC+VEGF组。
1.4动物模型的制备
以大鼠背部为术区，用脱毛剂（硫化钠、无磷洗衣粉、马铃薯粉混合制成，质量比为3∶1∶1）脱毛，常规消毒。麻醉后沿标记的2cm×5cm矩形皮瓣切开皮肤全层至肌筋膜上方，皮瓣纵轴与大鼠长轴平行，左右对称。将制备好的VEGF按照不同分组的设计需要分6个注射点局部注射于筋膜下，将MSC（第4、5代
细胞）培养物涂于筋膜上。
1.5临床观察
术后每日观察实验动物是否出现腹泻、弓背、翘毛、精神萎靡及皮肤溃疡等移植物抗宿主病（graftversushostdisease，GVHD）的表现；同时观察皮瓣的颜色、厚度、弹性、渗出、毛发生长情况和坏死范围，以及皮瓣筋膜上血管生成情况和针刺皮瓣出血情况。
1.6皮瓣成活百分率的测定
皮瓣坏死标准：皮瓣颜色发黑，质地坚硬，经病理检测证实发生坏死。皮瓣存活面积计算方法：术后14d麻醉动物，用龙胆紫描画皮瓣的范围及坏
死部位，以市售硫酸纸临摹绘制，以不同颜色区分坏死与成活区域；用计数坐标纸格子数的方法计算皮瓣成活面积并换算为成活百分率，即皮瓣成活面积占整个皮瓣的比例。
1.7组织病理学检查
术后14d于皮瓣中轴线上距离蒂部4cm处取皮瓣全层，常规脱水包埋、切片，苏木精-伊红（hemato-
xylin-eosin，HE）染色，于光镜下观察组织学变化。
1.8统计学分析
采用SPSS11.0统计学软件进行统计学分析，统计学方法采用卡方检验和t检验，检验水准为双侧α=0.05。
2结果
2.1MSC的分离、培养、鉴定结果
培养24～48h后，镜下可见散在的贴壁细胞，呈纺锤形；培养7～10d，细胞形成放射状克隆。培养过程中发现，这种细胞的形态相对单一，增长速度和贴壁速度快，易被胰酶消化，传10代以上其形态及生长特性亦无明显改变。培养16～30d，培养板上细胞汇合达80%～90%，呈叠瓦样或漩涡状排列（图
1）。经流式细胞仪检测，培养的细胞不表达造血细胞表面标志CD34和CD45，人白细胞位点DR抗原（hu-manleukocyteantigenlocusDR，HLA-DR）持续阴性，CD29和CD44，CD73、CD105、CD166持续为阳性。成脂诱导结果：诱导2周后用油红O染色，可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色（图2）。成骨诱
导结果：经硝酸银染色，诱导组细胞呈深黑色，结节处染色更加浓厚，为强阳性结果，表明有大量的钙盐沉积（图3）。
×40
2.2临床大体观察
实验过程中，各组大鼠均未见腹泻、弓背、翘毛、精神萎靡及皮肤溃疡等GVHD表现，所有实验动物无死亡及感染现象。术后第7天，皮瓣坏死区域稳定，成活与坏死区界限基本清楚，远端均形成较硬的痂壳。成活皮肤质地颜色与周围完全一致，有毛发生长。结痂面积（即坏死组织）按多少排序依次为A、C、B、D组。3个实验组皮瓣结痂面积均小于空白对照组，MSC+VEGF组的结痂面积小于VEGF组和MSC组。术后第14天，皮瓣成活情况与术后第7天无明显差异（图4）。
2.3皮瓣成活百分率
空白对照组、VEGF组、MSC组、MSC+VEGF组动物的皮瓣成活百分率分别为55.4%±4.4%、70.7%±6.3%、65.1%±7.1%、93.4%±9.4%。经统计学检验，3个实验组的皮瓣成活百分率均高于空白对照组（P
0.05），VEGF和MSC组间无明显差异（P>0.05）；MSC+VEGF组成活百分率最高，高于其他3组，差异均有统计学意义（P
2.4组织病理学检查结果
空白对照组可见大量炎症细胞浸润和坏死组织，细胞成分少见，新生血管较少；VEGF组肉芽组织较为丰富，细胞成分较多，有较多的新生血管；MSC组亦可见肉芽组织、细胞成分及新生血管，但均较VEGF组数量少；MSC+VEGF组肉芽组织最为丰富，成纤维细胞多且新生毛细血管最为丰富（图5）。
3讨论
随意皮瓣是临床上常用的一种皮瓣，微小血管是这种皮瓣主要的血液供应渠道，皮瓣内部的血液循环是影响皮瓣成活的最主要因素，故超出一定的长宽比例往往会出现皮瓣远蒂端的缺血缺氧或坏死。VEGF是内皮细胞有丝分裂因子，可诱导内皮细胞增生和毛细血管袢的形成，促进活体血管的生成。MSC是一种具有多向分化潜能和自我复制功能的早期未分化细胞，在特定条件下可以分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官。
目前大多数实验均采用贴壁筛选法和密度梯度离心法相结合的方法分离纯化MSC。MSC没有特异性表面标志物，其鉴定常采用联合鉴定法。Frieden-stein等[3]采用流式细胞术进行分析，显示原代培养细
胞的同源性可达到95%～98%，2代以后可达100%。本实验所培养细胞的流式细胞术检测结果和成脂、成骨诱导结果证明采用贴壁筛选法和密度梯度离心法结合的方法分离培养的MSC纯度较高，具有高分化潜能，用于动物实验可以发挥其生物学特性。
目前对于MSC的研究主要采用同种异体途径。有学者[4-5]认为：同种异体MSC移植的低免疫原性与MSC的纯度密切相关，纯化的MSC具有独特的免疫原性。Mansilla等[6]通过实验性研究证实了人MSC没
有免疫反应性并且可以通过物种间防御屏障，注入低级脊椎动物后不会引起血液动力学紊乱。本实验选取第4、5代MSC用于动物实验，整个过程中大鼠均未出现腹泻、弓背、翘毛、精神萎靡及皮肤溃疡等GVHD表现，说明所培养的MSC纯度较高，也证明人MSC没有免疫反应性或者具有低免疫反应性的特征，跨物种应用不会引起免疫排斥反应。
多数学者认为干细胞功能的发挥与其周围局部微环境的相互作用密切相关，MSC的分化方向与微环境壁龛（niche）密切相关[7]，其分化方向由微环境所调控。Fang等[8]发现：移植的MSC具有向病变部位迁移并分化成机体所需的相应细胞的能力。MSC可分化成为成纤维细胞和内皮祖细胞[9]，前者是皮肤重
建的重要细胞，后者参与伤后1周内的组织重建及组织重建过程中的血管形成。国内外关于MSC和VEGF提高皮瓣成活率的报道很多，但是将二者联合应用
来探讨其有效性的研究还较少。本研究将VEGF和MSC联合应用于超比例随意皮瓣，并设空白对照组、单纯MSC和VEGF组，通过临床大体观察和组织病理学方法观察术后皮瓣远端的血管新生情况及血管密度，探讨VEGF和MSC两种物质在分别应用和联合应用的情况下对促进超比例皮瓣成活率的有效性。临床大体观察可见各组大鼠在整个实验过程中均未出现死亡及皮瓣感染的情况。空白对照组结痂最快、面积最大，MSC组较VEGF组结痂速度快，VEGF+MSC组结痂速度最慢、面积最小。术后第7天，各组实验动物皮瓣坏死区域稳定，成活与坏死界限基本清楚，远端均形成较硬的痂壳。成活皮肤质地颜色与周围完全一致，有毛发生长。4组动物中，VEGF和MSC联合应用组的皮瓣成活率最高。组织学检查可见MSC组真皮下毛细血管增多，肉芽组织及成纤维细胞增多，但均较VEGF组少；VEGF+MSC组皮瓣真皮下肉芽组织丰富、成纤维细胞增多、胶原纤维排列规整、新生毛细血管最多。以上实验结果证明了VEGF和MSC均可促进超比例随意皮瓣远蒂端新生血管的形成，提高皮瓣成活率。VEGF与MSC的联合应用对微血管新生的促进作用明显优于二者单独应用的情况，二者在提高超比例随意皮瓣成活率方面有协同作用。
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[关键词]肝细胞生长因子；超长任意皮瓣；血管内皮细胞；存活率
[中图分类号]R622[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）03-0430-04
Experimentalstudyoneffectofhepatocytegrowthfactoronthesurvivalrateofrandomultra-longskinflapontheratback
WANGJia-rui,LIUDa-en,NONGQing-wen,LIShun-tang,LIANGKun-lan,LIKai-tong
（DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,Guangxi,China）
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheangiogenesisfunctionofhepatocytegrowthfactor(HGF)torandomultra-longskinflapontheratbackanditseffectonthesurvivalrateoftheskinflap.MethodsMakinga8.0cm×2.0cmanimalmodelfromarandomultra-longskinflapontheratback,injecteddirectlywith50ng/mlHGFsolution,after7daysobservingthecoloroftheskinflap,texture,capillaryreturn,necroticarea,bleedingconditionofthecutflapetc.;Calculatingthesurvivalareaoftheflap;Afterimmunitystaining,countingbloodcapillarywitha400opticalmicroscope.Makingresultsthroughcomparingthedisparitybetweenthebefore-experimentalflapandthatofafter--experiment.,Andalsocomparingwiththesalinecontrolgroup.ResultsComparingthesurvivalrate(81.45%±2.74%)oftheHGFskinflapwiththecontrolgroup(42.82%±7.03%),thedifferencesarestatisticallysignificant(P0.05);Afterexperiment,thequantityofcapillaryoftheexperimentalgroupandthecontrolgrouparerespectively（39.67±4.83)and(21.50±1.87),Thedifferencebetweenthetwoisofstatisticsignificance(P
Keywords:hepatocytegrowthfactor(HGF)；randomultra-longskinflap；vascularendothelialcells；survival
皮瓣修复是创伤（烧伤）、整形外科常用的治疗手段，传统的任意皮瓣的长宽之比为（2.0～1.5）∶1，超过此比例皮瓣远端常常会发生坏死导致手术失败而需要再次手术，给病人及家属带来痛苦和经济负担。目前临床上常用丹参注射液、低分子右旋糖酐及前列腺素E1、罂粟碱等通过疏通微循环方式或增加皮瓣血流量的方式来增加皮瓣血供，但临床应用中发现均缺乏唯一特异性。因此，预防和治疗皮瓣远端的坏死一直是皮瓣修复创面研究的热点及有待于解决的难点。研究表明[1]肝细胞生长因子（Hepatocytegrowthfactor，HGF)是继血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)后第三种能够促新生血管生长因子。Taniyama等[2]在体内外试验研究均表明其促进血管生成的活性比前两者更强大。但既往对HGF的研究主要集中于在肿瘤组织中的表达及缺血性疾病的血管再生的研究，经查阅国内文献，未见有关促进皮瓣血管生成的报道。本实验通过免疫组化染色后计算毛细血管密度、观察皮瓣存活面积，探讨HGF对大鼠背部任意皮瓣血管生成的作用及对皮瓣存活率的影响，为寻找预防和治疗皮瓣远端坏死提供一种的新思路和新方法。
1材料和方法
1.1实验试剂及器械：健康标准成年S-D大鼠，体重300～350g、雌雄不限（广西医科大动物实验中心提供）。肝细胞生长因子（美国PeproTech公司）,鼠抗人单克隆CD+34抗体MAB-0034（福州迈新生物技术开发技术有限公司），快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（福州迈新生物技术开发技术有限公司），DAB显色试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司）。显微镜及病理图像分析仪DMR+Q550（德国LEICA公司），实验在广西医科大学动物实验中心及一附院完成。
1.2实验方法
1.2.1HGF溶液的稀释配制：启用前离心，用Hanks液配制成2000ng/ml的原液后分装于10个分装瓶中。加10%FBS溶液及Hanks液配制成50ng/ml贴上标签，在-20℃冰箱保存备用。
1.2.2动物模型制备及实验分组：健康标准成年S-D大鼠20只，体重300～350g，随机分成A、B两组，每组10只，A组：HGF；B组：生理盐水组。10%水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉，将动物俯卧位固定，背部用硫化钠脱毛后温水洗净。于大鼠背正中掀起8.0cm×2.0cm任意皮瓣，其纵轴与大鼠脊柱平行，且以之为对称轴，蒂位于双侧髂嵴连线上。在距离蒂部3.6cm、4.8cm、6.0cm处分别作为蒂部平行的直线，与顺皮瓣长轴的三等分线相交于六点，这六点为注射位点[3]。切开皮肤及皮下，于筋膜浅层掀起皮瓣，结扎基底部活跃出血点。皮瓣掀起后即刻以1ml微量注射器于皮下进针，A组皮瓣下每一注射位点给予50ng/mlHGF溶液0.5ml，B组皮瓣下每一注射位点给予生理盐水0.5ml。4-0丝线将皮瓣原位间断缝合。术后切口涂四环素软膏，单笼喂养。所有手术均由同一人完成。
1.3检测指标
1.3.1术后大体观察：观察动物术后的饮食、活动及创面愈合情况。
1.3.2皮瓣大体观察，存活率的检测：术后7天处死大鼠，皮瓣存活区与坏死区已明确。皮瓣坏死标准：皮肤颜色变黑、组织回缩、弹性差、质地变硬、切割组织不出血。用透明纸绘出皮瓣形状及坏死皮瓣大小，将坏死区域涂成黑色，数码相机拍照并输入计算机，使用病理图像分析仪DMR+Q550计算出坏死面积。存活面积=设计面积一坏死面积，按(存活面积/坏死面积)×100%计算出存活面积比。
1.3.3组织学观察：术后7天，切取皮肤标本(在存活区，距存活与坏死交界处0.5cm)，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，HE染色，光镜200倍下观察其组织学变化、毛细血管管腔情况。
1.3.4免疫组织化学染色进行微血管分析：10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片；融蜡后用纯二甲苯中浸泡；不同浓度酒精梯度水化后冲洗；3%H2O2甲醇溶液封闭内源性过氧物酶的活性后冲洗；柠檬酸组织抗原修复液工作液高压抗原修复；滴加鼠抗人单克隆CD+34抗体MAB-0034后4℃恒温箱过夜；37℃复温后冲洗；滴加即用型IgG抗体-HRP多聚体，室温下孵育后冲洗；滴加新鲜配置的DBA显色剂，控制染色后自来水冲洗，终止显色反应；苏木素轻度复染后1%盐酸酒精水化，自来水冲洗；PBS冲洗返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。所有切片均按照试剂盒的要求在相同条件下染色。镜下随机选取4个视野，以单个血管内皮细胞或成簇的血管内皮细胞作为一个毛细血管，单个高倍镜视野下微血管的数目，取其平均值。测出每个高倍镜视野面积，并计算单位面积下微血管数目(个/mm2)，作为评价微血管密度的指标。
1.4统计学处理：数据均用(x±s)表示，采用SPSS16.0统计软件进行分析。两组间比较采用完全随机两样本均数比较t检验，两组数据经正态检验。
2结果
2.1术后大体观察：大鼠到实验结束均存活，饮食、排便正常，没有术后感染、化脓、体液渗出等不良反应。
2.2皮瓣大体观察：存活率的检测A、B两组皮瓣远端均出现不同程度的皮肤颜色变黑、质地变硬、切割组织不出血，出现明显的坏死迹象。A组皮瓣成活区域皮肤的颜色、弹性及质地与正常皮肤组织更相似，坏死区域面积比B组少。A、B两组皮瓣成活面积分别为(81.45%±2.74%)、(42.82%±7.03%)，两组间皮瓣存活率差异有统计学意义(t=16.192，P=0.000)。
2.3组织学观察：术后7天，A、B两组大鼠皮瓣均有毛细血管腔出现，真皮层内有大量的血管内皮细胞。A组管腔数量明显多于B组，且管腔的结构好，管腔壁变薄富有弹性，管腔内可见红细胞。B组虽然有大量内皮细胞存活，但呈现无序排列，红细胞沉积较少（如图1～3）。
2.4免疫组织化学染色分析：术前及术后7天两组大鼠背部皮瓣CD+34免疫组织化学染色计算毛细血管的平均密度：A组分别为12.70±1.35、39.67±4.83；B组分别为12.31±1.22，21.50±1.87。实验前A组、B组差异无统计学意义(t=0.667，P=0.513)，实验后A组、B组差异有统计学意义(t=11.100，P=0.000)，A组实验后与实验前差异有统计学意(t=16.253,t=0.000)，B组实验后与实验前差异有统计学意义(t=13.992，t=0.000)。（如图4～6）。
3讨论
3.1HGF是MichalLopoulos等[4-5]在部分肝被切除后的大鼠血浆中发现能够刺激肝细胞DNA合成的多肽因子，后经提取纯化并命名的一种具有多功能的间质源性细胞因子。它是由分子量75kD的重链(亦称α链)和分子量30kD的轻链(亦称β链)通过二硫键构成的二聚体。其主要来源于肝脏枯否氏细胞、内皮细胞、成纤维细胞、贮脂细胞、肺脏内皮细胞以及恶性肿瘤细胞。
3.2任意皮瓣移植后，其血运主要靠蒂部的不知名的血管、真皮下血管网、筋膜血管网等周围血管束的侧支供血，同时皮瓣远端的毛细血管的快速形成对预防及治疗远端缺血也起重要的作用[6]。新生血管的形成是一个非常复杂的过程，首先血管扩张及通透性增加，后经过血管基底膜酶解，血管内皮细胞活化、增殖、迁移、血管腔形成，周边细胞及平滑肌细胞的作用等多个步骤协调有序地完成，最后形成新生血管网。国内外在心脏缺血性动物模型的研究[7-8]均表明HGF能够促进缺血性心肌的微小血管再生，增加内皮细胞的数量及心肌的血流量。等[9]在体外培养牛的视网膜血管内皮细胞实验也证明HGF能够促进血管内皮细胞的增生和移行，且呈剂量依赖关系，当加入HGF质量浓度为100ng/ml时达到最大促血管内皮细胞增生和移行效果。其机制可能为：
3.2.1HGF通过其受体c-met直接作用于血管内皮细胞，刺激血管内皮细胞移行、增生、生长、产生蛋白酶、促进组织侵袭和机化，内皮细胞在细胞外基质间隙扩散,伸出胞浆芽并延长,使毛细血管样的导管形成。Nakamura等[10]在于大鼠血管的平滑肌细胞和内皮细胞中的局部发现了HGF/c-Met系统。唐博[11]等有研究表明HGF通过促使血管内皮细胞超微结构的改变，线粒体和粗面内质网增多，常染色质增多。能有效地促进血管内皮细胞的有丝分裂过程，细胞周期中S期、G2／M期细胞增多，尤其能促使细胞进入M期，这些都说明HGF是一种强的有丝分裂原。
3.2.2HGF可通过诱导VEGF的表达而促进的血管内皮细胞的生成、生长和转移，且二者具有协同作用。HGF可通过PI3激酶通路诱导VEGF的分泌和表达，从而间接促进血管的生成[12]。由此，罗泊涛等[13]在研究鼻咽癌中HGF和VEGF的表达意义的结果时提出了通过抑制HGF靶分子表达和活性来抑制肿瘤细胞中VEGF的表达，从而抑制肿瘤血管生成，达到抑制肿瘤生长和转移的目的设想。
3.2.3HGF可促进血管内皮细胞的发生、生存和再生，抑制细胞凋亡。周一军等[14]通过HGF抑制糖基化终产物诱导在体外培养人脐静脉内皮细胞研究结果表明：HGF可显著降低内皮细胞凋亡率，抗凋亡的bcl-2基因表达明显升高，而促凋亡Bax基因表达无明显变化,caspase-3活性显著降低。GopalkrIshnapilla等[15]研究发现在高糖环境下HGF能够抑制内皮细胞的程序性死亡，促进血管内皮细胞再修复。
3.3本实验采用直接皮下局部注射质量浓度为50ng/ml，每只大鼠注射总量为150ng，术后7天皮瓣存活率HGF组（81.45%±2.74%）高于生理盐水组的（42.82%±7.03%），减少皮瓣移植后远端的坏死；免疫组化染色计算毛细血管密度HGF组（39.67±4.83）高于生理盐水对照组（21.50±1.87），促进了皮瓣血管的生成。以上证据提示HGF可促使皮瓣血管内皮细胞再生、增生和新生血管的形成，减少皮瓣远端的坏死，提高皮瓣的成活率。其机制可能为HGF直接作用于血管内皮细胞，刺激血管内皮细胞移行、增生、生长、产生蛋白酶、促进组织侵袭和机化，内皮细胞在细胞外基质间隙扩散,伸出胞浆芽并延长,使毛细血管样的导管形成，具体的机制有待于进一步的研究。
3.4本实验结果显示：HGF通过促进皮瓣内血管再生、新生血管形成，提高皮瓣的成存活率，具有一定的应用前景。但该研究还处在初始阶段，取得的资料及经验还不多，如HGF的剂量、效应时间、在体内易被蛋白酶分解、半衰期短、局部一次使用生物学效应不能充分发挥和远期安全性、分化的机制及新生血管的稳定性缺乏足够的认识，许多实际问题有待进一步研究。
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