【关键词】组织工程生物陶瓷软骨修复软骨细胞成骨细胞
Abstract［Objective］Toevaluatethefeasibilityofrepairingcartilagedefectwithtissue-engineeredcartilage，whichwasmadeofchondrocytesandosteoblastseededontoabiodegradableporousbioceramicβ-tricalciumphosphate(β-TCP)［Method］Aporousbioceramictemplateofβ-TCPwascreatedintheshapeofacircularcylinderChondrocytesandosteoblastsinducedfromdogbonemarrowstemcellswereseededontotheβ-TCPandthenkeptthemgrowingtogetherfor1weekpriortotransplantationintothecartilagedefectsAfter12，16weeks，thespecimenswereharvestedandexaminedmacroscopically，histologicallyandimmunohistochemically［Result］Grossmorphologicalandhistologicalanalysisofthespecimensfromtheβ-TCPcomplexdemonstratednewcartilageconstructionTheresultwasbetterthanthatincontrolgroup［Conclusion］Thesefindingssuggestthatporousbioceramic(β-TCP)isagood“matrix”forchondrocytesandosteoblasts，andcanbeusedforcartilageengineering
Keywords：tissueengineering;bioceramic;repairofcartilage;chondrocyte;osteoblast
关节软骨损伤是骨科临床的常见疾病，软骨损伤的修复一直是关节外科的一个难题。20世纪80年代以来，组织工程技术的迅速发展，为这一难题的解决提供了一种可行性的方法［1］。作者采用软骨组织工程技术，体外分离骨髓间充质干细胞（MCSc）为种子细胞，将其诱导为成骨细胞和软骨细胞，与β-磷酸三钙多孔陶瓷（β-TCP）复合培养后，移植到犬关节软骨缺损处，通过组织学及组织化学等观察，以了解和评估其软骨修复性能。
1材料和方法
11材料及仪器
（1）DMEM培养基等试剂为Gibco公司产品。（2）β-TCP多孔陶瓷材料:由上海贝奥路生物材料有限公司提供。材料平均孔径为400~600μm，孔隙率为75%±10%，气孔沟通率达100%。
12方法
121MSCs的提取及诱导培养
自比格犬股骨大转子下穿刺抽取约7ml骨髓，Percoll分离法分离骨髓间充质干细胞，用含10%胎牛血清和青霉素及链霉素的L-DMEM培养液在37℃、5%CO2、95%相对湿度的培养箱中培养。4d后分别换含软骨细胞诱导因子、成骨细胞诱导因子的条件培养液继续培养。成骨细胞诱导因子的组成：地塞米松10nmol／L，β-甘油磷酸钠10mmol／L，维生素C50mg／L；软骨细胞诱导因子的组成：转化生长因子β110ng／L，胰岛素10u／ml，地塞米松100nmol／L。122Ⅱ型胶原免疫组化
在细胞诱导培养的第14d，应用Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒（购于武汉博士德公司）在细胞爬片上染色并计算阳性细胞数。
123碱性磷酸酶染色
采用Gomori法，将无菌玻片放入培养皿中，待细胞长至半汇后取出，PBS冲洗后用冷丙酮固定10min，蒸馏水冲洗数次；置于孵育液中（组成：3%β-甘油磷酸钠5ml，2%巴比妥钠5ml，蒸馏水10ml，2%CaCl210ml，2%MgSO41ml），37℃孵育4~6h，自来水再冲洗数次；2%硝酸钴中浸3~5min，蒸馏水再冲洗数次；1%的硫化铵中浸泡2min，自来水冲洗，自然干燥，封固，光镜下观察。
124矿化结节染色
采用茜素红法，培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，蒸馏水冲洗3次；加入少量01%茜素红-Tris-HCL(PH83)，置于37℃培养箱中30min后，蒸馏水冲洗，干燥，封片，光镜下观察。
125体外构建细胞-生物陶瓷复合体
含软骨细胞诱导因子条件培养液培养BMSCs至14d，取1ml细胞悬液（含细胞2×107个）接种到β-TCP支架上，形成上端为软骨细胞的复合体，培养1周后，将1ml成骨细胞诱导因子条件培养液培养BMSCs至14d的细胞悬液（含细胞2×107个）注入软骨细胞-生物陶瓷复合体下端，形成软骨细胞-成骨细胞-β-TCP复合体(骨软骨细胞生物陶瓷复合体)，复合体培养1周后，行扫描电镜观察细胞贴附情况。
126骨缺损的建立及复合体的植入
比格犬15只，体重10~12kg。用外径为6mm的环锯与股骨纵轴及矢状轴垂直方向在股骨髁最宽大处制成直径为6mm，深10mm的腔隙性缺损，根据植入骨类型分为三组：Ⅰ组：软骨缺损处植入软骨细胞-成骨细胞-β-TCP复合体；Ⅱ组：缺损处全层植入软骨细胞-未诱导分化组的MSCs-β-TCP复合体；Ⅲ组：空白对照，不植入任何材料。
于材料植入后的第12周、16周分两批处死动物，第1批每组2只动物，第2批每组3只动物，取材包括股骨下端的关节面，行镜下组织学观察及关节软骨缺损的组织学评分。
2结果
21细胞转化结果
211Ⅱ型胶原免疫组化结果
诱导培养后第14d，MSCs定向分化为软骨细胞的阳性表现为细胞浆内棕黄色细密颗粒。光镜下MSCs细胞的胞浆染成黄色或棕黄色为阳性信号。A组细胞阳性染色，B组:有少许阳性细胞。在20×10视野下，每张爬片平均阳性细胞数见表1。
表1Ⅱ型胶原免疫组化阳性细胞数（个／视野）组别标本数阳性细胞数A组(加软骨细胞诱导液组)52353±375B组（对照组，只加培养基）5549±294A组与B组比较：t=473有显著性差异P＜005
212碱性磷酸酶（ALP）染色
成骨细胞具有合成分泌ALP功能，功能活跃的成骨细胞ALP组织化学染色呈阳性反应。采用钙钴法，如图1a。
213矿化结节染色
成骨细胞具有体外矿化的特征，培养细胞可形成肉眼可见的白色矿化结节，采用茜素红法染色显示。如图1b。
214骨软骨细胞复合体培养1周后，行扫描电镜观察细胞贴附情况，分别显示软骨细胞、成骨细胞在β-TCP支架上粘附、伸展和增殖良好。如图2a，2b。
22犬股骨髁骨缺损修复的组织学观察
术后12周：Ⅰ组，缺损区形成透明样软骨组织，比周围正常软骨偏厚，软骨细胞数量多，出现明显的规律，表面层的软骨细胞平行关节面排列，深层纵向排列，软骨基质染色较四周淡，软骨下骨丰富。Ⅱ组，边缘区厚度与周围正常软骨接近，软骨细胞排列不规则，与周围软骨结合可，无明显裂隙存在。近中央区仍以纤维组织修复为主，细胞数很少，局部有裂隙。Ⅲ组表面为纤维组织，细胞成分较少。
转贴于
术后16周：Ⅰ组，缺损区软骨厚度较正常软骨组织厚，细胞排列规律好，与透明软骨组织相似，软骨下骨形成，潮线基本恢复，与周围正常软骨连接较好，如图3a；Ⅱ组，边缘修复区较正常软骨组织薄，软骨细胞排列不规则，中央区以纤维修复为主，如图3b；Ⅲ组，缺损区内主要为纤维组织，如图3c。
23组织学评分结果比较
软骨缺损修复的组织学评分标准见表2，12周、16周后各组软骨修复组织学评分结果如表3，说明Ⅰ组组织学评分明显优于Ⅱ组和Ⅲ组，表现在细胞数量多，软骨组织生长快，基质丰富，表面光滑，与周围正常软骨组织整合好。
表2关节软骨缺损修复的组织学评分标准分值细胞形态基质染（着色度）表面修复情况(占修复表面的面积)软骨厚度（与周围正常软骨比较）与周围宿主的整合度0透明软骨正常（与周围宿主正常软骨比较）光滑（＞3/4）＞2/3两侧均有界限1大部分为透明软骨轻度减退中度光滑(＞1/2-3/4)1/3-2/3一侧无界限2大部分为纤维软骨明显减退不规整（1/4-1/2）＜1/3两侧均无界限3仅有少量软骨无染色＜1/4－－4无软骨－－－－表3各组软骨修复组织组织学评分结果组别标本数时间12周末16周末Ⅰ565±03542±012Ⅱ598±04175±023Ⅲ5132±026105±042表明：各时间段Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅲ组比较均有显著性差异，P＜005
3讨论
关节软骨损伤难以自身修复，曾经采用过的治疗方法［2］，包括关节灌洗术和关节清理术、骨髓刺激技术（磨削关节成形术、软骨下骨钻孔术、微骨折术）、自体或异体软骨膜和骨膜移植等，但是，以上方法疗效都很有限，修复组织也多以纤维软骨为主，缺乏正常透明软骨的力学性能及耐用性，并且经常发生并发症［3］，组织工程学的发展有望解决这一难题。图1a成骨细胞碱性磷酸酶染色（钙钴法）显示犬成骨细胞胞质内灰黑色颗粒或块状沉淀（200×）
图1b矿化结节茜素红染色，显示不同形态矿化结节（40×）图2a软骨细胞－支架复合体扫描电镜（100×）图2b成骨细胞－支架复合体扫描电镜（100×）图3aⅠ组缺损区软骨下骨结合紧密，潮线形成，与周围软骨组织融合好图3bⅡ组缺损由纤维组织修复，细胞排列规律，与软骨下骨结合尚可，局部有裂隙图3cⅢ组缺损部分由纤维组织修复，排列杂乱，见分泌基质31种子细胞的选择
种子细胞的获取是组织工程技术构建软骨的基础。理想的种子细胞应具备以下特点：（1）取材方便，对供体损伤小，来源充足；（2）体外培养增殖能力强，能持续保持细胞表型不变；（3）植入人体后能适应受区环境，并保持或恢复原有细胞的功能。目前，最常用的种子细胞有间充质干细胞(MSCs)、胚胎干细胞(ESCs)和自体软骨细胞。
MSCs在适宜的条件下分化成骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪、骨髓基质等，具有典型的干细胞特点，终身存在于骨髓和其他组织器官中，负责组织的修复和更新［4］。MSCs可从患者自体骨髓穿刺获得，操作简单，并发症少，可避免产生免疫排斥反应，其传代增殖能力很强，多次传代仍可保持良好的增殖分化活性，在体外培养过程中始终保持多向分化潜能，但体内含量少，因此在植入人体前需体外培养扩增。ESCs也具有多向分化潜能，经定向诱导和分化，可获得无免疫排斥性的软骨细胞，但是，使用ESCs作为种子细胞存在着伦理学问题，并且，种植于体内可形成包含三个胚层的细胞畸胎瘤，所以如何有效控制ESCs向特定类型细胞分化有待进一步研究。自体软骨细胞可由骨关节软骨、肋软骨、骺板软骨等软骨组织分离培养获得，在严格的三维条件下培养，自体软骨细胞可以维持表型稳定达8个月之久，数量可以扩增2000倍以上，但自体软骨细胞常规培养传代和增殖能力有限，在体外培养过程中易发生去分化现象［5］，且其活性随着患者年龄的增长而明显下降，蛋白多糖分泌减少，丧失成软骨能力。自体软骨细胞来源有限，且难以用少量的自体软骨细胞经体外培养而获得大量具有正常功能的软骨细胞，这一缺点大大限制了自体软骨细胞在关节软骨缺损修复中的临床应用。
32细胞因子的作用
大量研究证实生长因子如转化生长因子-β1(TGF-β1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白（BMP）、胰岛素样生长因子（IGFs）等对软骨细胞的增殖、代谢及干细胞向软骨细胞分化过程中发挥重要的作用［6］。TGF-β1和IGFs均可促进软骨细胞的增殖、分化和软骨基质的合成；bFGF对多种属细胞有促进有丝分裂的作用，能促进软骨细胞增殖并促使其分化，促进软骨基质合成，使修复组织更厚，并含有更多的蛋白多糖和Ⅱ型胶原；BMP可促进软骨细胞合成基质，改善软骨的修复；细胞介素（IL）-10等细胞因子也对软骨细胞的增殖代谢有保护作用［7］。
33合适的生物支架材料
寻找新型细胞支架材料目前已经成为软骨组织工程研究的热点之一。当前，在组织工程中可作为细胞培养支架的生物支架材料主要分为两类，即天然生物支架材料和人工合成的支架材料。天然生物支架材料具有细胞信号识别，促进细胞的黏附、增殖和分化良好的生物相容性及良好的生物降解性等优点［8］；人工合成的支架材料可大规模生产，且其生物学和力学特性可根据需要进行改变。其中可降解的人工合成支架材料的生物学特征类似胶原，其多孔结构可以方便种子细胞的长入，且其降解性避免了取出移植物的手术损伤。生长因子和其他一些药性刺激因子同样可以涂于支架上面以刺激细胞增殖和分化。
在本实验中作者选用的材料是β－TCP多孔陶瓷，该材料具有良好的生物相容性和生物降解性，机械强度高，孔径大小适合细胞长入，体内完全降解时间为4个月左右。以该材料为支架接种软骨细胞和成骨细胞，体外构造骨软骨复合体，在体内成功地培养出具有三维立体形态及组织学特征良好的新生软骨组织，表明β-TCP多孔陶瓷是软骨细胞和成骨细胞较为适宜的载体材料，其微结构适宜新生软骨的形成。
研究结果表明，MSCs适合成为软骨组织工程的种子细胞，β-TCP支架是理想的软骨组织工程支架材料。MSCs经向软骨细胞、成骨细胞定向分化后复合β-TCP支架材料，在体内构建骨软骨复合体，可以有效修复骨软骨缺损。相信通过上述研究的不断完善和深入，将能够使这种新型生物性人工软骨广泛用于人体各种软骨组织缺损的修复治疗中。
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【关键词】骨性关节炎透明质酸钠分子量
中图分类号：R684文献标识码：B文章编号：1005-0515（2011）11-264-02
骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病,是老年人关节功能障碍和致残最常见的原因之一[1]。透明质酸钠(sodiumhyaluronate)广泛存在于生物体内，为关节腔滑液的主要成分，也是软骨基质主要成分之一，关节腔内注射透明质酸钠可明显改善滑液组织的炎症反应，提高滑液中透明质酸钠含量，保护关节软骨，促进关节软骨的愈合与再生，缓解疼痛，增加关节的活动度，因此关节腔内注射透明质酸钠是一种安全可靠的治疗膝骨性关节炎的方法[2]。透明质酸属于粘多糖的一种，由特定的重复双糖单位构成，具有良好的生物相容性、自动粘附性和可吸收性，这对滑膜关节的、软骨的保护以及对关节生物力学特性的维持起着重要作用[3]。组成透明质酸钠的基本双糖单位的多少决定了它的分子量大小，不同分子量的透明质酸钠在治疗上具有不同的临床意义。本研究即选用不同厂家、不同分子量的透明质酸钠，针对骨性关节炎修复治疗作用的特点开展了实验研究。
1材料与方法
1.1实验动物新西兰大白兔，体重(2.2±0.3)kg，郑州大学医学院动物实验中心提供，自由觅食和饮水，室温(23±2)℃，自然光照。
1.2药品透明质酸钠注射液，透明质酸钠25mg，分子量90万(阿尔治，2.5ml/支，日本生化学工业株式会社生产，批号7726)；透明质酸钠注射液，透明质酸钠20mg，分子量150～250万(施沛特，2.0ml／支，山东博士伦福瑞达制药有限公司生产，批号070211022)
1.3实验方法
采用木瓜蛋白酶致兔膝骨性关节炎进行病理学研究。4组新西兰大白兔，每组15只，分为两个给药组(大分子量透明质酸钠组和小分子量透明质酸钠组)、空白对照组和生理盐水对照组(NS组)。其中，给药组和生理盐水对照组关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节病变模型，空白对照组不做造模。兔右膝关节腔内注入1.6％木瓜蛋白酶(Merck产品)生理盐水溶液0.5ml，隔3天后，再注射第2次，共注射木瓜蛋白酶2次。于末次注射后的第7天，对治疗组和NS组分别在右膝关节腔内注射药物和生理盐水0.3ml，每周1次，共5周。于末次注射后的第7天，将兔处死，打开关节腔进行大体观察后取标本，进行组织学研究。对侧标本作为正常对照。观察指标：膝关节有无积液和滑膜肿胀等滑膜炎表现，并于解剖显微镜下观察股骨内髁关节面的病理改变。按以下标准评分：
0分：关节面光整，色泽如常；
1分：关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；
2分：关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表中层；
3分：关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；
4分：软骨剥脱，软骨下骨质暴露。
取膝关节股骨髁及部分半月板软骨和滑膜做光镜标本。滑膜行4％多聚甲醛固定，再按常规脱水、浸蜡、包埋、切片、HE染色观察滑膜形态学变化。软骨标本采用4％多聚甲醛(pH7.4)固定72h，15％乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙10周，石蜡包埋，HE染色观察软骨形态学变化。
1.4统计学处理结果采用SPSSl7.0软件处理，采取单因素方差分析(one―wayANOVA)检验，以P
2结果
透明质酸钠对木瓜蛋白酶致兔膝骨性关节炎的治疗作用病理学研究显示，空白对照组关节软骨排列规整，层次无明显异常，生理盐水对照组滑膜组织增生，血管扩张充血，大量炎细胞浸润，大分子量透明质酸钠组显示滑膜组织增生，炎细胞浸润，但与生理盐水对照组相比改善显著；小分子量透明质酸钠组关节软骨和滑膜炎性改变较轻，较生理盐水对照组改善非常显著。
表l病理学评分显示，大、小分子量透明质酸钠治疗组较生理盐水对照组均有显著性差异，两种药物治疗效果明确。其中，小分子量透明质酸钠组较模型组差异非常显著(P
表1木瓜蛋白酶致兔膝骨性关节炎各组股骨内髁关节面的病理学评分
（1）P
3讨论
透明质酸钠为广泛存在于动物和人体内的生理活性物质。在人皮肤、关节滑膜液、脐带、房水、眼玻璃体中均有分布。自20世纪70年代以来，透明质酸钠应用于临床治疗骨性关节炎，疗效确切[3,4]。本品具有高度的粘弹性、可塑性、以及良好的生物相容性，在预防粘连和修复软组织方面有明显作用。透明质酸钠为关节滑液的主要成分，是软骨基质的成分之一。在关节腔内起作用，可覆盖和保护关节软骨，改善关节挛缩，抑制软骨变性变化表面，改善病理性关节液，增加功能。还可抑制局部炎症的发生，从而延缓关节软骨退行性变的进程，通过遮蔽痛觉感受器以降低痛觉敏感性，缓解关节疼痛[5]。
本实验旨在观察不同分子量构成的透明质酸钠对骨性关节炎的治疗作用及其差异。选用目前国内临床常用的阿尔治和施沛特这两种不同分子量范围的透明质酸钠，阿尔治分子量90万，施沛特分子量150～250万，可见，施沛特主要为相对大分子量透明质酸钠，阿尔治主要为相对小分子量透明质酸钠。
研究结果表明，在木瓜蛋白酶注射法制造的兔膝骨性关节炎模型中，骨性关节炎病理表现更严重，大分子量与小分子量透明质酸钠两组药物均显示有明确的治疗作用，其中，小分子量透明质酸钠组与生理盐水对照组比较改善更明显，较大分子量透明质酸钠组也有显著差异，提示小分子量透明质酸钠可能在促进软骨组织修复和减少滑膜组织增生方面治疗效果较好，优于大分子量透明质酸钠。可能机制是小分子量透明质酸钠更容易与纤维母细胞上的蛋白质结合，使纤维母细胞表现出运动活性，向组织损伤处移行，促进愈合，有保证营养物质渗透作用，为损伤细胞增生、合成、分泌胶原提供充足营养。
参考文献
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[4]TasciotaogluF，OnerC．Efficacyofintra-articularsodiumhyaluronateinthetreatmentof
膝关节骨性关节病（KneeOsteoarthritis）简称膝OA，又称膝关节骨性关节炎，是骨科常见病、多发病。本病以中老年人居多，据流行病学报道［1］，在美国50岁以上的人群中，骨关节炎的发病率居全部病种中的第2位。在美国65岁以上有影像学异常的人群中，骨关节炎发病率约为70%，其中膝关节的发病率居第3位，且女性的发病率高于男性。该病最主要的临床表现为膝关节疼痛，尤以上下楼及蹲下站起时为著，部分患者膝关节反复肿胀，活动时有弹响，若日久失治可出现膝关节内翻或外翻畸形，最终导致膝关节功能丧失。
王平主任医师从事临床科研工作近20年，特别是对膝关节疾病颇有造诣。对于本病的治疗，王师认为首先应明确诊断，然后根据病人病情所处阶段，分期论治。在治疗时，王师特别强调应筋骨并重、关节内外同治，此外，王师还指出，本病宜早诊断，早治疗。笔者有幸师从王师，得其悉心教诲，受益匪浅。现将王师治疗中早期膝OA经验与特色总结如下。
1病因病机
膝OA的病因病机十分复杂，传统医学认为该病属中医“骨痹”范畴。王师认为本病的病因病机从中医角度上讲：人至中年，肝肾渐亏，气血渐虚，筋骨失养，不荣则痛，此属内因；膝关节长期劳损，加之跌仆扭伤，气滞血淤，风寒湿邪趁机侵袭，留滞经络，导致气血运行不畅，不通则痛，此为外因。内外因素共同作用发为本病。
现代医学认为本病的发生与年龄、性别、体重、种族、气候等因素有关，其病理改变与骨内压升高、氧自由基和一氧化氮、自身免疫反应、细胞因子和生长因子等有关。一般认为［2］，OA是力学和生物学因素的共同作用下，软骨细胞、软骨细胞外基质及软骨下骨3者降解和合成失衡的结果。从现代医学角度分析：王师认为该病病理改变虽以关节内的软骨退变为主，但关节外的肌肉、韧带、肌腱因素也不可忽视，这些膝关节周围的软组织是维持膝关节生物力学稳定及平衡的重要因素。由于各种原因导致这平衡遭到破坏，是本病发生的重要因素，如股四头肌与其拮抗肌群发生病变，导致膝关节失稳，生物力学发生改变，关节软骨局部承受的压力过大，易致软骨损伤；同时，软骨的退变也容易造成关节周围软组织的病变，形成恶性循环，加快本病进程，故王师认为关节内外因素共同作用发为本病。
2治疗
2.1诊断与鉴别诊断王师认为诊断是治疗的前提，只有在诊断明确的基础上才能采取有效的治疗手段。王师诊断膝OA的标准是参照2003年中华医学会风湿病学会起草的《骨关节炎诊治指南（草案）》［3］推荐的诊断标准。由于导致膝关节疼痛的疾病很多，王师强调还要注意鉴别诊断，最常见的与风湿性关节炎、类风湿性关节炎、结核性关节炎、牛皮癣性关节炎、化脓性关节炎等相鉴别。
2.2筋骨并重、分期论治目前，临床上对膝OA的分级方法主要有X线分级法、MRI分级法、关节镜下分级法等。常用的为Kellgren和LawrenceX线分级法：0级：正常；Ⅰ级：关节间隙可疑变窄，可能有骨赘；Ⅱ级：有明显的骨赘，关节间隙变窄（少于正常关节间隙的1/2）；Ⅲ级：中等量骨赘，关节间隙变窄较明显，有硬化性改变（多于正常关节间隙的1/2）；Ⅳ级：大量骨赘，关节间隙明显变窄，严重硬化性病变及明显畸形。Recht的MRI分级标准：0级正常关节软骨；I级软骨分层结构消失，软骨内出现局限性低信号区，软骨表面光滑；Ⅱ级软骨表面轮廓轻至中度不规则，软骨缺损深度未及全层厚度的50%；Ⅲ级软骨表面轮廓中至重度不规则，软骨缺损深度深达全层厚度的50%以上，但未见完全脱落；Ⅳ级软骨全层缺损、剥脱，软骨下骨质暴露伴或不伴软骨下骨质信号改变。
2.2.1早期病变关节轻度疼痛，晨僵不超过10min，伸屈功能可：0～130°，触诊有摩擦感及滑膜肥厚感，X线检查见骨硬化或骨赘，关节间隙仍正常，MRI检查处于0级或Ⅰ级改变。
2.2.2中期病变关节疼痛或伴肿胀，晨僵不超过20min，伸屈功能轻度受限：5～110°，触诊有摩擦感及滑膜肥厚感。X线检查见关节间隙狭窄，MRI检查处于II或III级改变。
2.2.3后期病变关节疼痛、变形，晨僵不超过30min，伸屈功能严重受限：10～90°，X线检查见关节间隙明显狭窄，大量骨赘生成，负重面磨损或缺损，MRI检查为IV级表现。
王师根据患者的病情分期，采取筋骨并重的疗法治疗。“筋”指关节周围肌肉、韧带、肌腱、滑膜、关节囊等即现代医学所指的软组织，“骨”即指骨骼及关节软骨。《内经》曰：“诸筋者皆属于节”，说明人体之筋都附着于骨上，大筋联络关节，小筋附于骨外。筋骨并重和现代医学关节内外兼治理论是一致的。
对于早期患者，王师认为其病变虽有关节内的软骨退变，但其引起疼痛的主要原因是膝关节周围的肌肉、肌腱、韧带病变，如鹅足囊损伤，腘窝伤筋等导致膝关节周围软组织的平衡遭到破坏。故其治疗以关节外为主，关节内为辅。具体方法为：①理疗加中药离子导入。其机理是利用热力，使关节周围韧带松弛，局部血流加速。借助离子导入设备将具有通经活络，活血化瘀的中药渗入关节内，以达到“通则不痛”之目的；②骨伤推拿按摩。其主要手法有按、揉、拿捏、滚、擦、拨法。其机理是通过手法使关节周围肌肉肌腱及韧带粘连得以缓解。促进局部血液循环、淋巴结回流和炎性物质吸收，降低关节内压力，使膝关节肿痛得以缓解；③中药敷贴－消淤止痛膏及活血止痛膏。以上两种膏药均为本院制品，在临床应用多年，疗效显著，其作用是通过较长时间贴附于膝关节皮肤，使药物慢慢渗入皮肤内，而达到活血、消淤、止痛之目的；④中药熏洗。王师以伸筋透骨外洗汤为基本方，根据患者病情辨证加减，其主要作用是舒筋活络、活血化淤，使膝关节经络通利，气血运行通畅，则疼痛自止；⑤中药汤剂口服。王师根据中医辨证将患者主要分为3型而给予不同的方药治疗：气滞血瘀型主要用身痛逐瘀汤加减；寒湿痹阻型以独活寄生汤加减；肝肾亏虚型则以六味地黄丸为基本方加减。此法主要是通过补益肝肾，调理气血而达到内外兼治之目的；⑥针灸疗法。王师主穴选取膝眼、阳陵泉、足三里、梁丘，随证加减血海、丰隆、阴陵泉及阿是穴。其主要功效是通筋活络，消肿止痛。对于早期膝OA患者，王师往往根据病人不同病情采用一种或几种不同疗法综合应用，以期获得最佳效果。王师认为［4］随着基础研究的进一步深入，针对本病某一阶段某一类型，依据辨证论治的原则，专人专方专用，能获得更好疗效。特别是在膝OA早期应用中药配合针刺及手法按摩的综合治疗能够起到事半功倍的效果。
对于中期患者，王师认为关节内的软骨退变已较重，但关节外的因素也不可忽视，故其主张关节内外并重。其对于关节外的治疗主要有中药离子导入，中药敷贴和推拿按摩，其具体操作方法基本同上，但视病人具体情况根据中医辨证，适当调整药物和手法。其对关节内的治疗除了中药汤剂口服以全身调整外，还有膝关节腔注射施沛特，其主要成分是透明质酸钠（HA），HA是人体内6种最重要的糖胺聚糖之一，为粘多糖高分子物质，在膝关节腔里与蛋白结合成的蛋白质复合物游离于关节液中，黏附于关节软骨或滑膜表面，并组成软骨基质。其在关节腔里的生物学功能主要有：润滑和缓冲应力，抑制炎症反应，屏障作用。王师的具体操作是在严格无菌环境中，在局麻下，用注射器直接将HA2ml注入关节腔里，如果关节腔内有积液，则先抽出积液后再注入HA，之后稍许活动膝关节，以使HA均匀分布于关节腔内，最后加压包扎。1次/周，5次为1个疗程。对于有关节镜检加清理术适应证的患者，王师主张在微创下清理关节内退变的软骨，增生的滑膜、游离体等，以缓解其引起的继发症状。然而，由于膝关节骨性关节病病因复杂，病人个体的差异，临床报道部分患者术后膝关节仍残留一些疼痛［5］，王师建议患者术后进行系统的康复治疗，以期最大程度恢复膝关节功能。其具体方法有活血化瘀的中药熏洗，补肝肾、强筋骨的中药汤剂口服，骨伤推拿手法及系统的功能锻炼等。
对于后期患者，王师认为关节内的软骨已严重退变，关节面已严重磨损，必须先改善关节内的环境，然后再行关节外的治疗，方能取得较好疗效。如截骨术、人工关节置换术等。
此外，王师还建议患者平时要注意减轻关节负荷，如避免负重，减轻体重等；减少运动量，避免长时间步行、站立、蹲位和爬山运动。最好多卧床休息，但卧床休息时要注意膝关节的功能锻炼，如股四头肌等长收缩练习、蹬踏空车动作等，以增加股四头肌的力量，代偿部分膝关节功能。平时还要注意膝关节的保暖，避免寒凉刺激。
3典型病例
女，67岁，左膝关节疼痛半年余，加重1周。自诉半年前无明显诱因出现左膝关节疼痛，以上下楼时明显，自贴伤湿止痛膏后有所缓解，未系统治疗。1周前因受凉后疼痛加重，自贴膏药未见好转，遂来王师门诊求治。经查X线片示左膝关节股骨内侧髁及胫骨内侧平台有少量骨赘形成，股髌关节及胫股关节面硬化，髁间嵴变尖，内侧关节间隙较外侧略窄。查体：髌研磨试验(+)，挺髌试验(+)，麦氏征(-)，浮髌试验(-)，鹅足囊有压痛，伸屈功能：0～110°，苔白，脉沉缓。诊断为膝关节骨性关节病。治疗：理疗加中药离子导入、骨伤推拿手法按摩，1次/d，来门诊治疗。予中药敷贴睡觉前贴于膝关节，晨起摘除洗净皮肤，防止过敏。6d后，症状缓解80%，为巩固疗效，休息1d后，继续治疗6d，症状全部消失。
按：患者系老年女性，肝肾已亏，筋骨失养，故平素左膝疼痛。近又感受寒凉，寒邪凝滞经络，导致经气运行不利，发为膝痹。故给予理疗和中药离子导入以祛除寒邪，骨伤推拿手法按摩、中药敷贴以舒筋活络、行气活血。寒邪祛、经络通、气血行则疼痛自止。至于为何不予口服药，系考虑到患者患有心脏疾病，长期口服治疗心脏疾患药物，故不予口服药以免药物过多过杂刺激胃肠道。
参考文献
［1］邱贵兴．骨关节炎流行病学和病因学新进展［J］.继续医学教育，2005，19(7)：69.
［2］陈百成，张静．骨关节炎［M］.北京：人民卫生出版社，2004：1.
［3］中华医学会风湿病学分会．骨关节炎诊治指南(草案)［J］.中华风湿病学杂志，2003，7(11)：703.
［4］王平．中医外治法治疗膝关节骨性关节病的临床概况［J］.天津中医学院学报，2005，24(3)：177.