关键词：细胞凋亡；检测方法；分析评价
细胞凋亡（apoptosis）是细胞在一定的生理或病理状态下，遵循自身的程序，自己结束自己生命的过程。细胞凋亡不受到外部损伤因素直接导致的被动改变而属机体自身的生理活动，是由基因控制的、高度有序的细胞主动死亡过程，即程序性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD）[1]。它贯穿从受精、发育、成熟、衰老的整个生命过程，近年来一直是生命科学和医学领域各专业的研究热点。随着研究细胞凋亡的方法不断涌现和深入，分析手段日趋完善和成熟。现将细胞凋亡检测方法归纳如下。
1形态学检测
细胞凋亡是形态学名称，其特征性改变包括细胞浆固缩、体积缩小、细胞皱缩以及细胞核致密等。一般认为形态学变化是判断有无细胞凋亡的基础[2]。根据凋亡细胞固有形态特征，人们设计了多种不同的细胞凋亡形态学检测方法，常用的有：普通显微镜观察、荧光显微镜观察、共聚焦激光扫描显微镜观察、透射电子显微镜规察。普通光学显微镜只可以观察到细胞凋亡的大体形态胞膜起泡现象和凋亡小体。但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构，因此用光镜观察难以令人满意。通过电镜可以观察到有典型的凋亡细胞出现，其特征是细胞核体积缩小，染色质浓缩致密，并沿核膜分布形成新月体状，细胞膜微绒毛消失，但细胞浆内的各种细胞器基本正常。凋亡细胞的典型形态改变在透射电镜下能够得到最佳的体现，为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。电镜检测细胞凋亡的缺点是：只能定性，不能定量；样本制作处理过程复杂，设备相对昂贵，对检查者的技术水平要求较高[3-4]。
2DN段化检测
2.1DNA琼脂糖凝胶电泳检测法细胞凋亡时，DNA在内源性核酸内切酶的作用下.在核小体间被切割成180～200bp整数倍的单核苷酸片段。DNA裂解是标志细胞最终走向死亡的不可逆的重要过程。正常活细胞的DNA凝胶电泳为一条区带；而当细胞凋亡时，由于DNA被裂解成单核小体和寡聚核小体，电泳时呈现特征性的"阶梯状"（1adder）条带；而坏死细胞的DNA断裂为无特征的杂乱片断，利用此特征，既可确定细胞的凋亡，又可与坏死细胞区别。因此DNA凝胶电泳一度被认为是判定细胞凋亡的金标准之一[5]。这种检测方法简便宜行，成本低。但缺乏定位性特征，灵敏性不高，但在作群体细胞凋亡分析时具有一定意义。本方法被广泛应用于作群体细胞凋亡分析中[6]。
2.2EILSA法分析组蛋白细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA，产生180bp～200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。此法具有需要设备简单.敏感性高，所需细胞个数少等优点。其缺点是不能精确测定凋亡发生绝对量和提供细胞的组织学定位。试验过程中如果裂解细胞的时间过长可能导致细胞核中的DN段也被计算在内，进而导致结果偏高，因此不同的细胞系需要经过数次摸索才能确定最佳检测条件[7]。
2.3DN段原位标记法
2.3.1.原位缺口转移（insitunick-translation，ISNT）技术细胞发生凋亡时，核酸内切酶在DNA分子中导入切口，DNA多聚酶在切口部位表达外切酶活性，使核苷酸自5'向3'方向切去；同时以切口部位末端核苷酸的3'一OH为引物，利用DNA多聚酶I的聚合活性将未标记的核苷酸用标记的核苷酸进行置换，切口沿DNA分子移动，同时水解5'末端，以修复DNA原位切口平移技术将标记的核苷酸引入凋亡细胞的DNA，据此可检测凋亡细胞。
3流式细胞仪检测法
流式细胞仪（FCM）是将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集为一体，用于细胞定量分析和进行细胞分类研究的工具。此方法系通过荧光素如PI、hoechst等亲DNA的特性，分析悬浮细胞中DNA含量的直方图来判断细胞凋亡。①PI染色法：凋亡细胞经PI染色、流式细胞仪检测，在正常细胞G1期的峰前增加1个特异性亚二倍体峰（sub-G1峰）俗称"凋亡峰"。通过FCM测定DNA的含量还可以研究凋亡细胞的周期特异性。此方法的优点是可定量检测，灵敏度高。缺点是不能观察S期和G2期凋亡的细胞，不能区别坏死细胞和凋亡细胞。②Hoechst-PI法：此法可克服PI法的不足。hoechst被活细胞摄取后与DNA结合呈蓝色荧光；PI使坏死细胞呈红色荧光。因此，在直方图上可根据红蓝两种荧光判断3种细胞：正常细胞呈弱蓝、弱红光；凋亡细胞呈强蓝、弱红光；坏死细胞呈弱蓝、强红光[9]。③AnnexinV/PI法：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（Ps）迁移至细胞膜外侧。PS发生的变化即外露早于DNA断裂，早于染色质凝集及凋亡小体的形成，外露后成为免疫系统识别的标志，能与高亲和力的钙依赖性的磷脂结合蛋白AnnexinV结合，将AnnexinV进行荧光素（FITC、PE、ECFP）标记可以检测细胞凋亡，是最敏感的指标之一，但坏死细胞Ps亦暴露于外表使AnnexinV结合阳性，因此使用AnnexinV这一参数不能区分坏死或凋亡，必须同时结合PI进行凋亡细胞双染后用流式细胞仪即可将凋亡细胞以及坏死细胞区分开来。结果判断正常活细胞Anmxin-V、PI均低染；凋亡细胞Anmedn-V高染、PI低染；坏死细胞Anmxin-V、PI均高染。利用AnnexinV/PI法，是目前检测细胞凋亡最理想的方法。
4细胞凋亡相关物质的检测
4.1酶学检测
4.1.1半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases-3）活性检测细胞凋亡过程中有许多蛋白酶参与并相互协调以促进凋亡的发生。在凋亡的起始和执行过程中起关键作用的是半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspases）。大多数凋亡都涉及Caspase-3的活化，它是关键的凋亡执行分子.Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡早期阶段被激活它通过分解去除DNA酶的一个负调节亚基而问接使之活化，实现了DNA的片段化，最终发生细胞凋亡。常采用荧光分光光度计检测其活性。因活化的Caspase-3能够特异切割DIE2V3D4-X底物，水解D4-X肽键，故设计出荧光物质偶联的短肽Ac_DEVDAMC。短肽被水解后释放出的AMC能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度大小，可测定Caspase-3活性，从而反映Caspase-3的活化度，以判断细胞凋亡程度[10]。
4.1.2乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是主要存在于神经系统的一种水解酶，其经典功能是水解神经递质乙酰胆碱从而终止神经冲动的传递[11]。张学军等[12]发现乙酰胆碱在细胞凋亡追踪起重要作用，他们以人肺成纤维细胞株、NIH/3T3小鼠、HEL、PC-3和牛肉皮细胞等为材料，用衰老凋亡或化疗药物诱导法诱导细胞凋亡，综合流式细胞术、DNA电泳、形态学及TUNEL等方法检测凋亡细胞，发现各类细胞在正常状态下无AchE活性反应。一旦发生凋亡，均具有AchE活性反应，从而建立了这一检测凋亡细胞的新方法[13]。酶学检测简单、快速、方便，适合大量培养细胞的凋亡检测，但不能定量和定位。
4.2细胞凋亡相关基因水平的检测在细胞凋亡时有些基因表达异常，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas蛋白结合受体后形成死亡介导信号复合体（DISC），能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞等靶细胞调亡[14]。Bcl-2和Bcl-XL作为抗凋亡的调节物，它们的表达水平比例决定细胞是凋亡还是存活[15]。现多采用Northern杂交和RT-PCR对它们进行检测，随着近年来荧光定量PCR技术的发展，用定量PCR来检测基因表达水平较前者更快更准确。
总之，目前检测细胞凋亡的方法很多，但都有其自身的优点和局限性。应充分了解各种检测方法的原理及应用范围，根据标本综合选择几种适当的方法进行检测，常可得到较准确结果。在进行细胞凋亡检测的时候，要几种方法进行检测，避免使用单一方法。例如：电镜观察仍是确定凋亡的最具权威的标准.因此在凋亡定量控测之前应先行电镜观察定性；PI染色流式细胞检测法漏检率及错检率均高.不适于凋亡定量观察.但其方法简便、价廉，适用于大批标本的筛选预试验；TUNEL法是目前最常用的凋亡检测技术.为避免坏死细胞的影响，应先用荧光镜检以保证TUNEL染色细胞不存在坏死细胞，否则应另选其它检测方法。
综上所述，只有几种不同的检测方法进行综合检测得到的结果，才能真正的反映细胞发生凋亡的情况，进而准确的对其凋亡进行定性和定量判定。相信伴随着人类对凋亡机制更加深入的了解，操作简单、敏感性高、成本低廉的细胞凋亡检测方法会越来越多，也将对基础细胞生物学，生物医学及临床某些疾病的诊断及治疗产生深远影响。
参考文献：
[1]张晓晖，姚天明，黄高异，等.细胞凋亡的最新研究进展[J].第四军医大学学报，2002，23（1）：42-44.
[2]BortnerCD，CidlowskiJA.ANecessaryRoleforCellShrinkageinApoptosis[J].BiochemicalPharmacology，1998，56（12）：1549-1559.
[3]邱红，邵淑丽.细胞凋亡的检测方法[J].高师理科学刊，2006，26.
[4]王嘉宁，郭宁.细胞凋亡的检测技术与方法[J].中国药理学与毒理学杂志，2005，19（6）：466-467.
[5]ComptonMM，CidlowskyJA.RapidinvivoeffectsofglucOcorticOidsontheintegrityofratlymphocyteGenomicdeoxyribonucleicacid[J].Endocrinology，1986，118：38-45
[6]姜泊.分子生物学常用实验方法[M]北京：人民军医出版社，1996：70-183.
[7]张广智，胡长敏，陈颖钰，等.细胞凋亡的主要检测方法研究进展[J].动物医学进展，2011，32（8）：89-92.
[8]PavlovskyZ，VagundaV.Apoptosis2selectedmethodsofdetectionofapoptosisandassociatedregulatoryfactorsontissuesecionsoftumors[J].CeskPatol，2003，39（1）：6.
[9]刘伍梅，汪铭书，程安春.细胞凋亡检测技术的研究进展[J].中国兽医科技，2004，34（11）：45-48
[10]郭延锋，高均伟，朱国坡，等.细胞凋亡常用检测方法的研究进展[J].中国畜牧兽医，2010，37（2）：90-92.
[11]顾琪，朱汉民，贺恒益，等.乙酰胆碱酯酶染色法观察体外培养成骨细胞的凋亡[J].老年医学与保健，2001，7（4）：218-219.
[12]杨磊，张学军.乙酰胆碱酯酶参与细胞凋亡的研究进展[J].细胞生物学杂志，2002，（5）：321.
[13]孙建平，谭竹钧，韩雅莉.细胞凋亡检测方法的研究进展[J].生物技术通报，2012，（1）：54-59.
[14]MedemaJP，ScaffidiC，PeterHKetalBcl-xlactsdownstreamofcaspase-8activationbytheCD95death-inducingsiginalingcomples[J].BiolChem，1998，273（6）：3388-3393.
到目前为止，口腔颌面恶性肿瘤病人的5年生存率已达65％左右，其中，口腔癌细胞系的建立和应用起了不可忽视的作用。这些细胞系为体外和体内研究肿瘤的生物学特性、诊断、治疗提供了有形的载体，它涉及到肿瘤的放疗、化疗、免疫治疗、基因治疗等各个方面的基础和临床前研究。继1981年我国首次建立第一株人口腔癌细胞系Tca8113之后［1］，20余年来我国相继建立了20余株口腔癌细胞系。本文就已建立的口腔癌细胞系和其主要生物学特点做一综述。
1国内已建立的口腔癌细胞系及其特点
1.1国内建立的细胞系
继人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113建立以来，国内建立的细胞系还有人颊黏膜鳞癌BCaCD885、腭腺样囊性癌ACC2、腮腺腺样囊性癌ACC3、舌下腺腺样囊性癌SACC83、腭黏液表皮样癌MEC1、人小涎腺腺样囊性癌NACC细胞系、人牙龈癌颈淋巴结转移细胞系GNM及舌鳞癌细胞系TSCCa［2］，以及与上述细胞系相关的6株高转移细胞系和3株耐化疗药物的细胞系。此外还建立了来源于嚼槟榔而无吸烟史者右颊黏膜鳞癌细胞系OC3［3］，腭黏膜黑色素瘤细胞系ME［4］，等等。
1.2国内建立的常用细胞系的生物学特征
1.2.1Tca8113细胞系系列Tca8113细胞系来源于人舌鳞状细胞癌，由上海第二医科大学附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室何荣根等［1］建立，至今已有23年，该细胞系生长稳定，初建系时群体倍增时间为38.8h，分裂指数高峰值为61‰，平板集落形成率为86.0％；染色体多数稳定在66条，为亚三倍体，有M1标记的染色体，连续传代仍保留此有价值标记的染色体；接种于兔抗小鼠胸腺细胞血清ATS处理的C57BL和ICR小鼠皮下，成瘤率为100％。周晓健等［5］在此细胞系的基础上建立了对顺铂（CDDP）耐药的细胞系Tca8113/CDDP，耐顺铂的剂量为9.2mg/L。张建国等［6］建立了耐长春新碱细胞系Tca8113/V100，耐长春新碱剂量为100μmol/L。第四军医大学口腔医学院吴军正等［7］于1999年通过裸鼠尾静脉注射Tca8113细胞，取一有神经症状的裸鼠脑组织原代培养，建成了高转移的细胞系Tb，该细胞染色体多数为66条，裸鼠皮下接种成瘤率100％；与Tca8113细胞相比，Tb细胞中线粒体更发达，分泌颗粒多，S期细胞百分比高，群体倍增时间短，软琼脂克隆形成率高，在裸鼠体内的实验性肺转移能力明显提高。又通过裸鼠舌黏膜下注射Tb细胞，取颈淋巴结转移灶建成细胞系TbTl，又将TbTl细胞经裸鼠尾静脉注射，取发现截瘫的裸鼠脊髓培养，建成了舌鳞癌脊髓转移细胞系Ts，该细胞染色体多数为60条，裸鼠皮下接种成瘤率为100％；与Tb细胞相比，Ts细胞群体倍增时间短，S期细胞百分比高，软琼脂克隆形成率高。
1.2.2BCaCD885细胞系人颊黏膜鳞状细胞癌细胞系，由华西医科大学口腔医学院廖小宜等［8］于1990年建立。该细胞系贴壁率高，2h达83％；分裂指数高峰值为79‰；群体倍增时间为40.5h；半固体琼脂培养克隆形成率为29.8％；平板集落形成率为10.3％；染色体多数为亚三倍体，有染色体畸变和15种异常染色体，其有价值的标记染色体为Inc7q；裸鼠皮下接种成瘤率为100％。
1.2.3MEC1细胞系系列人黏液表皮样癌细胞系MEC1，来源于腭部，由第四军医大学口腔医学院司徒镇强等于1990年建立。该细胞系在4h贴壁率为86.9％，群体倍增时间约30h，分裂指数高峰值为27‰；染色体为亚二倍体，44～46条；鼠抗人角蛋白抗体染色阳性，兔抗人分泌片（Sc）抗体和兔抗人溶菌酶抗体染色均阳性；细胞为单层生长，铺满瓶底后出现漂浮细胞，少见有重叠生长现象。该课题组在MEC1细胞系的基础上建立了耐药细胞系MEC1/FU，耐FU剂量为1.980μg/L，与MEC1相比，该细胞系增殖略快，软琼脂克隆形成率明显提高，S期细胞增多，部分解释了其耐药性产生的基础。该课题组又通过裸鼠尾静脉注射MEC1，筛选出高转移细胞克隆Mc3，与其母本细胞MEC1比较，Mc3具有生长较快，S期细胞比例较高，接触抑制力下降（饱和密度高），在软琼脂内克隆形成率高，野生型P53蛋白表达阳性率低，裸鼠实验性肺转移率高等生物学特点，表明Mc3是一个高转移细胞株。该课题组用Mc3细胞经裸鼠涎腺移植，鼠间原位移植后获得转移力提高的M3SP2细胞系。杨宏林等将Mc3经尾静脉注射获得截瘫的裸鼠，取其脊髓培养，建立了细胞系Ms，与Mc3相比，Ms增殖速度和克隆形成率均较高，但裸鼠皮下接种成瘤速度慢。
1.2.4SACC83细胞系人涎腺腺样囊性癌细胞系，来源于左舌下腺，由北京大学口腔医学院李盛琳等［9］于1987年建立。该细胞高峰期分裂指数为44‰；染色体多数为98～100条，为亚四倍体；裸鼠皮下接种成瘤率为100％，以浓度5×108/L接种该细胞，于2个月时成瘤，这与腺样囊性癌转移、复发所需时间较其他肿瘤长的临床观察一致。该细胞电镜下观察主要由两种细胞组成，即闰管细胞和分泌细胞，有丰富的染色质和细胞器。此后，应用该细胞又建立了人涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞系SACCLM。
1.2.5ACC2、ACC3细胞系腺样囊性癌细胞系，为肺低转移细胞系，由上海第二医科大学附属第九人民医院口腔颌面外科何荣根等［10］于1988年建立。ACC2来源于右腭部小涎腺，ACC3源自右腮腺，苏木精伊红染色细胞呈印戒状，裸鼠皮下成瘤率为100%。细胞角蛋白（CK）染色阳性证明该细胞有上皮源性细胞的特征；细胞黏液组织化学反应表明细胞内有对淀粉酶消化抵抗的PAS和阿辛蓝染色阳性的黏蛋白颗粒；电镜下细胞浆内有张力原纤维和丰富的分泌颗粒，细胞间有桥粒连接，证实了腺样囊性癌起源于一种多能储备干细胞的观点，该癌细胞在体外培养分化程度下降。关晓峰等［11］在ACC2的基础上建立了肺高转移细胞系ACCM，该细胞实验性肺转移率为96％。
1.2.6NACC细胞系人小涎腺腺样囊性癌细胞系，来源于腭部，由农晓琳等［12］建立。该细胞系含有多种形态的细胞，方块形细胞可能为闰管细胞，类梭形细胞为肌上皮细胞，核大、细胞质及细胞器少的可能为未分化多能干细胞。该细胞4h贴壁率为70％，高峰期分裂指数为6.8％，染色体为68～70条，亚三倍体占90％以上，这与SACC83细胞系亚四倍体不同。裸鼠皮下接种成瘤率为100％。培养中可见分泌黏液样物质，免疫组化结果符合肿瘤性肌上皮细胞特性。NACC细胞系为不同分化程度和发育周期的癌细胞所组成的细胞群体。
2国外建立且常用的部分细胞系
国外常用的细胞系以日本建立者居多，其与国内建立的细胞系生物学特性相似。见表1。
3人口腔癌细胞系的共同特点
各种细胞系生长稳定，连续长期传代其生物学行为变化不大，与人体内肿瘤组织有相似或相同的生物学行为。上皮样癌细胞电镜下均有细胞桥粒、张力原纤维和角蛋白束。腺样囊性癌细胞有较强的分泌及合成功能，培养观察到其可分泌黏液样的物质，腺样囊性癌源于多能干细胞，由闰管细胞、分泌细胞、肌上皮细胞、多潜能干细胞组成，为由分化程度不一致和处在细胞个体发育周期不同阶段的细胞组成的非均质体。黏液表皮样癌具有上皮和黏液细胞癌两者的特点。
绝大部分口腔癌细胞系均能在裸鼠皮下接种成瘤，筛选到转移性细胞系的成瘤时间较母本细胞明显缩短［7，11］。
但是文献报道肿瘤的原代培养成功率低于30%，而建立一个永生化的稳定传代的细胞系其成功率仅为1%。李金荣等改进了建系的方法，将人口腔癌组织在裸鼠体内连续接种传代后，提高了瘤体中细胞的纯度和体外适应能力，然后再进行组织块原代培养，易于建系。文献分析了381例肿瘤的裸鼠移植规律，发现人癌手术标本裸鼠异种移植的成功率为28.3%，其中复发性肿瘤移植成功率为50.0%，转移性肿瘤表1国外建立且常用的部分细胞系缩写名称和（或）来源建系者或保藏机构HSC2人口底癌细胞系日本国立癌研究中心HSC3、HSC4人舌癌细胞系OSC2、4、5、6口腔癌细胞系日本高知医科大学AW13516、8507舌鳞癌细胞系TATAKE等［13］AW10498下牙槽骨鳞癌细胞系AW9803磨牙后三角鳞癌细胞系HO1N1颊癌细胞系Ca922牙龈癌细胞系H1下牙龈癌细胞系HARADA等［14］NOS1下牙龈癌细胞系JI等［15］MSCC1牙龈癌淋巴结转移细胞系KUDO等［16］SAS舌鳞癌细胞系OKUMURA等［17］SASL1、SASH1分别为舌鳞癌低转移和高转移细胞系SQUUA、B舌鳞癌细胞系MASAAYOMORIFUJI等SCCUM1、SCCUM2分别为舌鳞癌高转移、低转移细胞系NAKAYAMA等［18］OSC19舌癌颈淋巴结转移细胞系KAWASHIRI等［19］OSC20舌癌颈淋巴结转移细胞系YOKOI等［20］SCC9、15、25、66、111口腔癌SCC系列KBOECM1、686LN、1483、Tu183口腔鳞癌细胞系KOSCC11高分化下牙龈癌细胞系LEE等［21］KOSCC25有A、B、C、D、E五种，下牙龈癌细胞系KOSCC33有A、B两种，上颌窦癌细胞系AMOSⅢ口底癌细胞系（无烟草吸食者）KAUR等［22］SACC、CAC2涎腺腺样囊性癌细胞系TYS、HSG涎腺癌细胞系为38.5%，均高于原发瘤的移植成功率20.5%，大约1/3的人癌组织在裸鼠中可持续性生长建立人肿瘤瘤株，当肿瘤传到第3代后，90%的移植瘤株可成为肿瘤细胞系。
总之，20多年来，国内、外建立的口腔癌细胞系种类较多，这些细胞系的大部分已为我国口腔癌的基础研究所应用，为研究肿瘤的生物学特征，探明口腔癌瘤侵袭和转移机制，进行各种细胞和分子水平的干预研究等提供了极为有用的实验材料。能建立长期生长、世代繁殖又具有原发肿瘤的各种生物学特征的细胞系是一件具有挑战性和创造性的工作，往往花费很长的时间，经过多次培养、多次失败后才偶获成功。建立具有自身特色的口腔癌细胞系，具有理论和实际意义。
【参考文献】
［1］何荣根，徐秀祺，张秀丽，等.人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系的建立及其生物学特性［J］.肿瘤，1983，3(3):97.［2］刘刚，李金荣，李祖兵，等.基质金属蛋白酶及其抑制剂与口腔鳞癌颈淋巴结转移的关系［J］.华西口腔医学杂志，2001，19(4):216.
［3］LINSC，LIUCJ，CHIUCP，etal.EstablishmentofOC3oralcarcinomacelllineandidentificationofNFkappaBactivationresponsestoarecanutextract［J］.JOralPatholMed，2004，33(2):79.［4］CHANGKW，LINSC，CHAOSY，etal.Establishmentandcharacterizationofanoralmelanomacellline(ME)［J］.OralOncol，2001，37(3):301.
［5］周晓健，陈万涛，李卿，等.Tca8113细胞系耐药性的实验研究［J］.上海口腔医学，2001，10(1):31.
［6］张建国，杜平，张杰，等.耐长春新碱人舌鳞癌细胞系Tca8113/V100的研究［J］.中华口腔医学杂志，1999，34(3):136.
［7］吴军正，陈建元，李峰，等.舌癌脑转移细胞系Tb的建立及形态和生长特性［J］.实用口腔医学杂志，1999，15(6):452.
［8］廖小宜，李芄，温玉明，等.人颊黏膜鳞状细胞癌BCaCD885细胞系的建立及其生物学特征［J］.华西口腔医学杂志，1990，8(4):238.
［9］李盛琳，刘绣屏，章魁华.人涎腺腺样囊性癌(SACC83)细胞系的建立及其生物学特性［J］.中华口腔医学杂志，1990，25(1):29.
［10］何荣根，张晓珊，周晓健，等.人涎腺腺样囊性癌ACC2和ACC3细胞系的建立及其形态学观察［J］.华西口腔医学杂志，1988，6(1):1.
［11］关晓峰，邱蔚六，何荣根，等.肺高转移性涎腺腺样囊性癌细胞株的筛选［J］.中华口腔医学杂志，1996，31(2):74.
［12］农晓琳，蒙敏，李佳荃，等.人类小涎腺腺样囊性癌NACC细胞系的建立及腺样囊性癌生物学特性的研究［J］.广西医科大学学报，1996，16(6):717.
［13］TATAKERJ，RAJARAMN，DAMLERN，etal.Establishmentandcharacterizationoffournewsquamouscellcarcinomacelllinesderivedfromoraltumors［J］.JCancerResClinOncol，1990，116(2):179.
［14］HARADAM，MIYATAK，WADAT，etal.Establishmentandcharacterizationofacellline(H1)fromsquamouscellcarcinomaofhumangingivaeffectoftemperature［J］.HumCell，1993，6(1):29.
［15］JIZW，OKUN，UMEDAM，etal.Establishmentofanoralsquamouscellcarcinomacellline(NOS1)exhibitingamplificationoftheerbB1oncogeneandpointmutationofp53tumorsuppressorgene:itsbiologicalcharacteristicsandanimalmodeloflocalinvasionbyorthotopictransplantationofthecellline［J］.OralOncol，2001，37(4):386.
［16］KUDOY，KITAJJMAS，SATOS，etal.Establishmentofanoralsquamouscellcarcinomacelllinewithhighinvasiveandp27degradationactivitiesfromalymphnodemetastasis［J］.OralOncol，2003，39(5):515.
探讨内生菌（CEB）代谢产物提高免疫功能的生物效应。方法
取CEB纯培养代谢产物用小白鼠进行体内试验，并设培养基、免疫抑制和生理盐水为对照。取小鼠血涂片，进行T淋巴细胞酸性酯酶染色，分别检测总T淋巴细胞、酸性酯酶阳性大颗粒及小颗粒T淋巴细胞，进行统计学处理。结果
CEB代谢产物组总T淋巴细胞、大颗粒、小颗粒T淋巴细胞分别为54.80%、38.20%、16.90%；显著高于对照组（41.90%、27.80%、14.10%，P
支持CEB培养代谢产物作为生物免疫激活剂，能促进淋巴细胞增值，提高免疫功能的理论。
【关键词】内生菌T淋巴细胞酸性酯酶有丝分裂因子
中国科学院武汉植物研究所张政铨、聂开印两位教授在世界上首次发现单子叶植物百合组织中与其互利共生的内生菌（CellEndophyteBacteriaCEB）［1］，其代谢产物富含天然维生素E、天然维生素C、维生素B6、多糖、谷胱甘肽、类SOD及生物碱等主要抗氧化物活性成分［2］。这一重大发现引起了国内外学者的广泛关注。为了弄清它们对T淋巴细胞的激活作用以及发挥这种作用的内在联系，我们设计并进行以下研究，企图探讨CEB代谢产物作为一种免疫增强剂的可能性，现将研究方法与结果整理报告如下。
1
材料与方法
1.1
实验材料
CEB代谢产物：系从CEB纯培养提取，由中国科学院武汉植物研究所内生菌研究室提供。内生菌生长液体培养基对照（以下简称培养基）：提供单位同上。环磷酰胺：200mg/ml。实验动物：昆明小白鼠，一级实验动物。
1.2
实验方法
1.2.1
对小鼠T细胞激活作用的观察
取20～24g小鼠40只，雄雌廉用，随机分成4组：1组为内生菌0.2ml/只；2组为培养基0.2ml/只；3组为环磷酰胺10mg/kg；4组为生理盐水0.2ml/只，各组均为每日腹腔注射1次，共7次，第8日摘眼球放血，涂片、干燥进行T细胞酸性醋酸酯酶染色［3］（染色育液：将4%付品红加入4%亚硝酸钠及9倍体积的1/15MPBS，pH7.6混匀，再加入α醋酸奈酯，pH5.2混匀备用），育染3h后取出流水冲洗，干燥后甲基绿染色1min。酸性醋酸酯酶染色阳性淋巴细胞为T淋巴细胞；并在油镜下计数紫红色大颗粒及小颗粒淋巴细胞，分别记录百分率。
1.2.2
统计学处理
将资料分类整理后录入Excel表格进行统计。计数资料进行χ2检验，计量资料进行t检验。以P
2
结果
CEB培养的代谢产物注射小鼠后，刺激小鼠的免疫系统致总T淋巴细胞显著增高，与生理盐水对照组比较，差异有非常显著性（P0.05），可见总T淋细胞的激活与培养基无关。第三组为环磷酰胺即免疫抑制组，T淋巴细胞明显低于生理盐水对照组（P
对小鼠总T淋巴细胞活化的影响注：表中统计学处理为各组与第四组比较
一般认为在T淋巴细胞酯酶染色中，大颗粒阳性细胞为T辅助型淋巴细胞，具有辅助B淋巴细胞及T抑制细胞的功能。在小鼠血片中表现为T细胞增生活跃，数量明显增加，颗粒粗大；第二组（培养基组）与生理盐水对照组其酯酶阳性大颗粒细胞数量基本一致（P>0.05）；第三组（环磷酰胺）则明显被抑制（P
对小鼠酸性醋酸酯酶阳性大颗粒型细胞的影响注：表中统计学处理为各组与第四组比较
一般认为酸性醋酸酯酶染色阳性中小颗粒型T细胞为具有免疫抑制功能的T细胞亚群。本研究（表3）证明，CEB代谢产物不仅能刺激辅助型T细胞活化（表2），亦能使抑制型T细胞活化，与对照组比较差异有显著性（P
对小鼠酸性醋酸酯酶阳性小颗粒型细胞的影响注：表中统计学处理为各组与第四组比较
3
讨论
S淋巴细胞是活动静止的细胞，但是当其受到适当刺激而活化时，它将发生急剧的改变。这些改变常按一个特征性的时间顺序进行，所以这些变化中的任何一个环节都能作为检测活化的指标。通常应用的试验是测定：（1）淋巴因子的产生；（2）淋巴细胞的增殖；（3）抗体的合成；（4）细胞毒性［4］。本研究采用的是检测淋巴细胞增殖试验。
淋巴细胞依靠特殊的表面受体首先接触免疫激活剂（抗原），这些受体是按照与抗原特异地相互作用而设计的。当抗原结合到特殊的受体即导致免疫活性细胞的活化，并以最大的效能和强度去执行免疫效应功能。
在体内或体外把抗原引入到淋巴细胞群中，将引起能识别抗原的那些细胞克隆活化。由抗原诱导的活化是非常特异的，一个特定的抗原只能活化随机的淋巴细胞群体中的一小部分。现已发现大多数抗原只能活化不到1%的随机的、未致敏的淋巴细胞［4］。很显然，内生菌代谢产物所致的淋巴细胞活化不属于抗原类。
还有一类物质能活化淋巴细胞，那就是致有丝分裂因子。致有丝分裂因子不像抗原那样只对少数淋巴细胞（特异性的）起活化作用，而是具有对很多种动物包括人在内的高百分比的淋巴细胞起激活作用。大多数致有丝分裂因子来源于植物或微生物［4］。因此，本实验研究的结果支持CEB培养代谢产物作为生物免疫激活剂，能促进淋巴细胞增值，提高免疫功能的理论。
参考文献
1
新华社.我发现单子叶植物细胞“内生菌”.北京：人民日报，1986，3：16.
2
美国博思维科实验室，给武汉德润生物技术有限公司的测试报告，Testingperfomedby:T.Zhang，Approvedby:BoxinOu，Ph.D.B-6904/12-1-07Hpji.
3
杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1990，47-52.
【关键词】种子细胞
【Abstract】AIM:Topurifyandculturehumanbonemarrowderivedendothelialprogenitorcells(EPCs)invitroandtoobservetheirbiologicalcharacteristics.METHODS:MononuclearcellswereisolatedfrombonemarrowsuspensionbydensitygradientcentrifugationandEPCswereharvestedintheendothelialgrowthmedium(EGM2).EPCswereobservedundermicroscope，thecellgrowthwascalculatedbycellcountingandthecellswereidentifiedbyelectronicmicroscopeexaminationandimmunofluorescencestainingfortheexpressionofⅧ/vWF，vascularendothelialgrowthfactorreceptor2（VEGFR2）.RESULTS:TheculturedishadherentEPCsuniformlyhadaroundorspindleshapeandreformedcloneswithcobblestonemorphology.ThecellscouldbeidentifiedbythepositivestainingforVEGFR2andⅧ/vWF.WeibelPaladlebodiescouldbeseenundertransmissionelectronmicroscope.CONCLUSION:EPCsareonegroupofstemcellsinthebonemarrowwiththecapacityofdifferentiatingintoendothelialcells.Theycanbepurifiedandculturedbydensitygradientcentrifugationandsubjectedtocultureinvitrowithendothelialgrowthmedium(EGM2MV).ThesefindingssuggestthatEPCsmaybeanewseedcelloftissueengineering.
【Keywords】bonemarrow;endothelium/cytology;stemcells;tissueengineering;seedcells
【摘要】目的：体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞，研究其基本生物学特性.方法：利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞，再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞，观察细胞生长特性，通过检测细胞血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和透射电镜对培养细胞进行鉴定.结果：原代培养后细胞贴壁生长，7~10d形成集落或融合呈卵石形，免疫组化荧光染色后结果显示VEGFR2，Ⅷ/vWF阳性，透射电镜显示细胞内具有特征性的WP小体.结论：用密度梯度离心法和条件培养可以从骨髓得到高纯度内皮前体干细胞，该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征，可以进一步分化为血管内皮细胞，是理想的组织工程种子细胞.
【关键词】骨髓；内皮/细胞学；干细胞；组织工程；种子细胞
0引言
随着干细胞研究的深入，研究者发现，内皮前体细胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）是具有活跃分化潜能的干细胞，具有游走特征并能进一步增殖分化为内皮细胞.它不仅参与胚胎期的血管发育，也存在于成年机体的骨髓和外周血中，在成体血管内皮细胞发育中起重要作用，可以作为种子细胞用于人工血管、组织工程瓣膜内皮化的研究与应用［1］.EPCs的研究愈来愈受到关注，但分离相对困难，关于其培养及生物学特性研究少见报道.为进一步探讨EPCs作为组织工程种子细胞的可能性与优越性，我们进行人骨髓内皮前体细胞的分离培养和生物学特性的研究.
1材料和方法
1.1材料
骨髓取自健康志愿者.内皮细胞生长培养基（EGM2，Clonetics，USA），内皮细胞生长培养基补充物（EGM2MVSingleQuots，Clonetics，USA），其中包含有胎牛血清（FBS）、血管内皮生长因子(VEGF）、成纤维细胞生长因子2(FGF2）、胰岛素样生长因子1(IGF1）以及抗生素等，黏连蛋白（FibronectinFn，Sigma），淋巴细胞分离液与PBS液（TBD公司），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡盐液（Gibco），VEGFR2兔抗（NeoMarkers，USA），第Ⅷ因子鼠抗(北京中山公司），二抗（FITC羊抗鼠与Cy3羊抗兔，Sigma），FITCconjugatedCD34鼠抗（R&D公司）.
1.2方法
1.2.1骨髓中单个核细胞的分离［2］无菌条件下，取人骨髓液5mL，加入肝素，用PBS液充分混匀，转入离心管，轻轻地层加到1077g/L的淋巴细胞分离液上，2000r/min离心20min，收集中间的单个核细胞层，用PBS液1000r/min离心洗涤2次×10min以洗除残余淋巴细胞分离液，然后收集细胞备用.
1.2.2EPCs的培养收集骨髓中单个核细胞，用含胎牛血清和多种生长因子的内皮细胞生长培养基混匀，制成细胞悬液，接种于以黏连蛋白（Fn）包被的培养瓶中，置37℃含50mL/LCO2孵箱中培养，第4日换液，去除非贴壁细胞，此后每3~4d换液1次.相差显微镜下观察细胞形态，待细胞长满瓶底的80%，用0.125g/L胰酶消化，并以2×107/L细胞数传入24孔培养板中，每日取4孔细胞进行计数并求均数，绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间.
1.2.3流式细胞仪检测取对数生长期骨髓EPCs，以0.125g/L胰酶消化后制备单细胞悬液，测定细胞生长周期；同时，检测细胞表面抗原CD34表达，鉴定所得细胞纯度.
1.2.4EPCs细胞表面抗原免疫荧光染色检测培养10d的细胞进行免疫荧光化学染色，检测细胞表面抗原VEGFR2与Ⅷ/vWF等表达情况，选取培养10d的成纤维细胞进行免疫荧光化学染色作为对照组.过程如下：细胞片用PBS液洗，然后用40g/L多聚甲醛常温处理30min，再用含50mg/L马血清和50mg/L小牛血清的PBS液浸泡30min，去除非特异性标记，再加入VEGFR2，Ⅷ因子mAb（1∶100），37℃孵育过夜，用PBS液洗3次，加入荧光标记二抗，37℃摇床孵育1h，荧光显微镜下拍照.
1.2.5电镜检查体外培养10d，离心收集EPCs，用3g/L戊二醛固定过夜，细胞团用PBS洗3次×10min，1g/L四氧化锇4℃固定30min，PBS洗3次×10min，丙酮系列脱水，包埋并制作超薄切片，透射电镜观察拍照.
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2结果
2.1骨髓EPCs体外培养及扩增用梯度密度离心法从骨髓中分离出单个核细胞层后，用内皮细胞生长条件培养基培养，并通过换液去除非贴壁细胞，所得贴壁细胞即为骨髓内皮前体细胞.原代培养4d内，细胞呈圆形（Fig1A）；培养7d后，细胞铺展呈椭圆形或短梭形，并迅速增殖，10d后出现细胞融合呈“铺路卵石样”（Fig1B），约14d可传代.传代后细胞于24h内完全贴壁，接种后第1~3日为潜伏适应期，从第4日起细胞增殖迅速并进入对数生长期，第7日达高峰，此后进入平台期，细胞生长曲线如Fig2所示.同时，依据生长曲线计算细胞群体倍增时间约为36h.
2.2流式细胞仪检测贴壁细胞消化后用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34表达，结果显示细胞均一性较好（阳性表达率72%），说明采用本实验中分离细胞的方法可得到较高纯度的骨髓EPCs.同时，流式细胞仪测定细胞生长周期，结果显示：G0/G1期细胞为71.1%，G2/M期细胞为14.7%，S期细胞为14.2%，说明EPCs细胞增殖比较活跃.
2.3骨髓EPCs表面标记的检测EPCs细胞均表达Ⅷ/vWF，免疫荧光染色呈阳性，细胞胞质呈绿色，胞核不染色（Fig3A）；EPCs细胞均表达VEGFR2，免疫荧光染色呈阳性，细胞胞质呈砖红色，胞核不染色（Fig3B）.对照组成纤维不表达Ⅷ/vWF与VEGFR2，免疫荧光染色呈阴性，细胞胞质和胞核均不染色.
2.4骨髓EPCs超微结构观察细胞边缘可见较多绒毛状突起，胞质内还见一种短棒状小体，即WeibelPalade氏小体，是内皮细胞特征性的细胞器（Fig4）.
3讨论
近年来研究发现，EPCs具有游走特征并能进一步增殖分化为内皮细胞，它不仅参与胚胎期的血管发育，也存在于成年机体的骨髓和外周血中，在成体血管内皮细胞发育中起重要作用.1997年Asahara等［3］成功地在体外将CD34+细胞诱导生成血管内皮细胞，并于体内证明其生血管能力，说明EPCs是CD34+细胞重要亚群.因此，EPCs有望成为血管组织工程内皮种子细胞的新来源.
EPCs是CD34+细胞重要亚群，多采用吸附单克隆抗体－磁珠分离系统(MACS)进行分离得到，此法所得细胞均一性好，纯度高，但价格昂贵，实用价值欠佳，同时，EPCs吞噬的磁性微粒也必然影响细胞的代谢及功能［4］.本实验中，根据细胞密度的差异，针对EPCs属于单核类细胞的特点，抽取骨髓后，用密度梯度离心法分离出单个核细胞层，再利用内皮细胞生长条件培养基外加黏连蛋白黏附特性，最终所得贴壁细胞即为EPCs.同时，我们对所得到的骨髓EPCs用流式细胞仪检测表面抗原表达，结果显示细胞均一性较好，CD34阳性表达率72%，也进一步鉴定了所得到的细胞为较高纯度的骨髓内皮前体细胞.此方法简单、经济、高效，具用较高的应用价值.
VEGFR2是内皮细胞生长的早期表面受体，主要出现在内皮细胞诱导转化的早期［5］.Ⅷ因子是内皮细胞特异性抗原，可以通过vWF的测定对内皮细胞进行鉴定［6］.本实验中人骨髓EPCs呈贴壁生长，随体外培养时间延长，其形态由早期圆形铺展呈椭圆形或短梭形，并迅速增殖，出现细胞融合呈“铺路卵石样”.培养一定时间后，细胞增殖速度由快变慢，胞体变大、胞质疏松，提示EPCs增殖活力下降.原代培养生长曲线显示，EPCs的体外培养经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，其增生分裂能力活跃，体外培养可以实现快速扩增.此外，分离得到的骨髓EPCs具有与血管内皮细胞共同的特征，细胞呈鹅卵石状贴壁生长，均表达VEGFR2，Ⅷ/vWF，胞质内还可见内皮细胞特异性标记短棒状小体，即WeibelPalade氏小体.
EPCs存在于成年机体的骨髓和外周血中，可以自体取材，避免新的机体创伤和免疫排斥反应.同时，EPCs增生分裂能力活跃，体外培养可以实现快速扩增，能进一步分化为内皮细胞，参与成体血管内皮细胞发育、创伤愈合、肿瘤生长等病理生理过程［7］.因此，EPCs可以作为理想的内皮种子细胞来源，用于人工血管、组织工程瓣膜内皮化研究，具有潜在的临床应用价值.
【参考文献】
［1］GrieseDP，EhsanA，MeloLG，etal.Isolationandtransplantationofautologouscirculatingendothelialcellsintodenudedvesselsandprostheticgrafts:Implicationsforcellbasedvasculartherapy［J］.Circulation，2003;108(21):2710-2715.
［2］郑奇军，蔡振杰，俞世强，等.骨髓间质干细胞体外定向心肌样分化的实验研究［J］.第四军医大学学报，2002；23（20）：1871-1873.
ZhengQJ，CaiZJ，YuSQ，etal.Experimentalstudyondifferentiationofmesenchymalstemcellsinbonemarrowtocardiomyocytesinvitro［J］.JFourthMilMedUniv，2002;23(20):1871-1873.
［3］AsaharaT，MuroharaT，SullivanA.Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis［J］.Science，1997;275(14):964-967.
［4］EggermannJ，KlicheS，JarmyG，etal.Endothelialprogenitorcellcultureanddifferentiationinvitro:Amethodologicalcomparisonusinghumanumbilicalcordblood［J］.CardiovasRes，2003;58:478-486.
1生产hiPSC衍生细胞以供药物毒性检测多潜能干细胞沿着特定的谱系分化的技术使研究细胞发育和细胞特异性的毒性成为可能。事实上,hiPSC分化而成的细胞的概念验证毒性试验支持大规模基于人类细胞的毒性筛选试验。但是,对于iPSC在药物筛选中的应用还有以下三个限制。其一是重编程的效率和分化的可重复性,对于hiPSC,重编程方法的效率低于0.1%。而分化过程同样在效率和差异性上面不令人满意并且需要很长的培养时间。其二是在iPSC的分离,诱导和成熟中发生的遗传和表观遗传改变,造成试验结果难于被解读。其三是获得成熟表型的细胞,获得一个完全成熟的细胞是个挑战,这会限制依赖于成熟细胞生化过程的毒性检测。
2hiPSC在毒性评估的几大应用人源诱导多能干细胞可以应用在毒性评估中的很多方面,下面主要讨论几个方面。
2.1发育毒性胚胎干细胞检测,作为动物检测的替代方法,是一种评估致瘤性危害的体外实验。该实验探讨了包括细胞毒性,终端分化,生物化学指标,蛋白组和基因组的检测值,以提高敏感性和检测额外的细胞毒性机制。生化通路的种属间差异危害是人源化此类发育毒性试验的原动力。由于hiPSC分化方法目前还不成熟,所以利用此类细胞的发育毒性研究局限在早期分化阶段,诱导分化方法的日益发展必将可以拓展评估致瘤性危害的发育窗口期。
2.2验证继发性药理学脱靶效应研究普遍利用细胞系统来完成。iPSC分化细胞可以在更生理化环境中表达相关靶标,当药理学特性依赖于靶标表达水平和信号转导蛋白相互作用时,则显得尤为关键,例如GPCRs,此靶标的相对丰度和细胞背景可以影响受体的药理学,因此,结合hiPSC和可在自然表达水平上分辨GPCR功能的技术[5]可以用来更加准确的评估一个候选药物的脱靶效应。
2.3评估器官特异毒性毒理学家一直努力发展各种分子、生化和细胞模型来重现已知毒性物质的特殊在体反应以及描述毒性物质作用通路。研究主要集中在肝脏,心脏,和大脑。例如,lin和will评估了549种分别有肝毒性,心毒性,神经毒性物质对来源于肝脏、心脏、和肾脏细胞其中ATP水平的作用,大部分的毒性物质对三种细胞都有着相同的效果,显示了不能用这样的一般指标来预测器官特异性毒性。器官特异性毒性可能来源于该组织特殊的生物特性,结合hiPSC分化细胞特异的功能参数可以阐明利用永生化细胞观察不到的毒性物质作用通路。结合兼容高通量的新技术,可以检测大量的合成物。这有助于在药物筛选早期对关键安全性危害进行评估并且有助于进一步利用追踪试验进行验证以确定安全性界限。
随着高新技术的发展和人们对生物医学认识的不断提高和更新，近年来医学基础研究呈现出飞跃式发展。人们利用不断发展开发的新技术，对人类各种疾病的发生发展进行了深入的研究和探讨。以下就泌尿系肿瘤基础研究的热点及我国存在的问题做一简要介绍。
1干细胞的研究
1.1骨髓间充质干细胞的研究骨髓间充质(mesenchymalstemcells，MSC)是骨髓间质细胞的前体细胞，它与骨髓微环境密切相关。人们已在体外成功分离出MSC，并能诱导分化为骨、软骨、神经细胞等多种其他组织细胞。近年来，MSC在组织工程重建尿路和泌尿系统器官方面的研究层出不穷，主要在先天性畸形、外伤、肿瘤和手术造成的组织缺损等，如尿道、输尿管、睾丸、膀胱等器官的组织工程重建均有研究报道。研究表明MSC可定向分化为膀胱上皮细胞、肌细胞以及新生器官必须的血管内皮细胞和神经细胞。体外实验证明MSC可分化为睾丸生精细胞和具有雄激素分泌功能的细胞。这为泌尿系肿瘤手术切除后组织和器官缺损的替代和功能恢复开拓新的领域。
1.2肿瘤干细胞的研究近年来，成体干细胞成为医学界倍受关注的课题之一。人们对干细胞的认识由造血干细胞的研究开始，后发展到对组织成体干细胞的研究。最近有人提出干细胞与肿瘤发生有关，认为肿瘤细胞中存在少数干细胞样肿瘤细胞，这可能是肿瘤细胞的启始细胞。由此提出了肿瘤干细胞(cancer/tumorstemcells)的新概念。也有人将其称为肿瘤启始细胞(tumorinitiatingcells)。这使人们对干细胞的认识更加深入一步。肿瘤干细胞的研究最早由Bonnet等在1997年研究急性粒细胞白血病发现白血病干细胞，随后涌现出大量的实体瘤干细胞研究。
肿瘤的发生与成体干细胞密切相关，许多肿瘤常起源于干细胞的突变或分化停止。人们同样发现肿瘤细胞与干细胞有着惊人的相似性，二者均具备很强的自我更新能力。MaryHendrix发现转移的肿瘤细胞在很多方面与干细胞相似，除了表面分子标志相似外，还具有干细胞的多能性。随着肿瘤干细胞被人们逐渐认识后，大量的实体肿瘤干细胞的研究相继问世，包括乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤等研究。最近，国内有膀胱癌、前列腺癌肿瘤干细胞研究的课题在进行中。肿瘤干细胞的研究将可能进一步揭示肿瘤的生物学行为，可以更好地指导肿瘤治疗，选择性的杀伤肿瘤干细胞从而切断肿瘤的起源，可能在预防肿瘤复发和转移方面有重要的意义，也可以通过检测肿瘤干细胞的特殊或特异的分子标记物早期诊断肿瘤，评价治疗效果和评估预后。
2细胞凋亡与肿瘤
大量的研究充分证明了肿瘤发生发展与细胞凋亡状态密切相关。细胞的程序死亡(凋亡)受到抑制时细胞大量增殖，使肿瘤发生、发展、复发，也可使肿瘤产生化疗耐药。细胞凋亡有两个主要的调节通路：一是bcl2/bax等凋亡相关蛋白的调节使细胞色素C释放，然后活化凋亡效应蛋白caspase9、caspase3、PARP，最终使DNA断裂细胞凋亡；另一个是Fas与细胞表面的FasL作用，激活了caspase8、caspase3、PPAR等使细胞发生凋亡。在细胞凋亡的过程中这些效应蛋白caspases起着关键作用。而这些凋亡效应蛋白受一组凋亡抑制蛋白(inhibitorsofapoptosis，IAPs)的调控。LIVIN和XIAP基因是新近发现的凋亡抑制蛋白家族新成员，可抑制凋亡效应蛋白caspase3，7，9等的活化，使细胞逃避凋亡。近几年国内外研究发现LIVIN和XIAP在膀胱癌组织中高表达，提示可能与膀胱癌发生、发展和复发相关。将XIAP基因转入膀胱癌细胞T24可使细胞凋亡受到抑制，细胞增殖活性增强。这些研究均表明凋亡抑制蛋白与移行细胞癌的发生和复发有着不可分割的联系。
大多数化疗药物是通过使细胞凋亡而发挥抗癌作用的。XIAP高表达的膀胱癌显示了对化疗药物的耐药性，是因为XIAP使肿瘤细胞凋亡受到抑制而产生抗药作用。在肾癌的研究中发现MDR1、GSTπ、topoⅡ等基因高表达是肾癌显示了强的抗化疗作用。针对泌尿系肿瘤化疗耐药的研究结果，大量的逆转耐药的研究也在展开，通过各种分子生物学手段阻断不同耐药基因或凋亡抑制蛋白的表达，在体外实验和动物实验中获得了明显的逆转耐药的作用。但是MDR(multidrugresistance)机制是一个极其复杂的过程，它通过不同的传导通路中多个基因的相互作用。因此，单一机制的研究远不能解决肿瘤耐药的问题，肿瘤耐药研究的展望包括：①多因素耐药的相互作用机制；②细胞凋亡和凋亡抑制与化疗耐药机制的研究。
细胞凋亡与肿瘤的发生、发展、复发和化疗耐药密切相关，深入研究细胞凋亡将可能阐明肿瘤发生、发展和耐药机制，也将是解决临床实际问题的基础。
3血管生成与肿瘤
新生血管的形成是肿瘤生长的基本条件。早在1863年，Virchow就注意到肿瘤组织中血管绝对数急剧增加，1945年Algire提出了肿瘤新生血管(neovascularization)的新概念。研究提示肿瘤生长分为两个时期：①血管形成前期，癌细胞的营养供应主要依靠周围组织的弥散作用；②血管期，当癌组织＞2-3mm或癌细胞数＞107时，肿瘤内出现新生血管。肿瘤细胞分泌多种促血管生成因子(VEGF，TGF，PDGF等)，它们促进内皮细胞迁移并形成新生血管。肿瘤血管为肿瘤细胞提供营养，同时为肿瘤转移提供了途径。肿瘤血管形成机制及通过阻断肿瘤血管进行防癌、治癌在几乎所有肿瘤研究中均有大量报道，包括肾癌、膀胱癌、前列腺癌等，其中对肾癌的研究具有突破性进展。VEGF在肿瘤血管形成中起到关键作用，人们针对VEGF传导通路已经研制出多个分子靶向治疗药物，包括单靶点药物和多靶点药物，其中多靶点药物Sorafinib和Sunitinib于2005年和2006年先后被美国FDA批准治疗晚期肾癌。这些药物显示了较好的临床治疗效果。在研究中人们先后发现了多个肿瘤血管生成的抑制因子，包括血管生成抑制素(angiostatin，AS)和内皮抑素(endostatin，ES)等，AS可作用于血管内皮细胞使其发生凋亡，ES可抑制内皮细胞迁移并促进其凋亡。
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4肿瘤标记物的研究
肿瘤标记物是在某一肿瘤特异性表达或分泌(或释放)，在其他肿瘤组织或正常组织不表达或低表达(低分泌或释放)的分子，即分子标记物(molecularmarker)或生物标记物(biomarker)。根据其临床功能可将肿瘤生物标记物分为：①肿瘤诊断，用于肿瘤早期诊断或治疗后的随访，肿瘤复发的早期诊断；②预后判断，用于判断肿瘤手术或治疗后无疾病生存或无进展生存；③化疗、放疗敏感性判断。肿瘤生物标记物的取材包括组织、血液、尿液、腹水和其他体液。泌尿系肿瘤生物标记物以膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌等的研究最为广泛和深入。
PSA是近20余年来前列腺癌诊断中的主要肿瘤标记物，用于前列腺癌的筛查、诊断、预后判断和随访。但由于PSA的特异性和敏感性较低，因此人们不断寻找更具有特异性和敏感性的标记物。PCA3是前列腺癌特异表达的基因，检测血PCA3mRNA特异性高于血PSA。最近研究发现检测尿PCA3/PSAmRNA(前列腺按摩后第一次尿)的特异性和敏感性明显高于血PSA，其诊断前列腺癌的特异性为76%-82%，敏感性为50%-63%，而同一组患者血PSA特异性仅为22%-42%(2006年AUA资料)。早期前列腺癌抗原(earlyprostatecancerantigen，EPCA)在前列腺癌特异表达，其前列腺癌诊断敏感性达80%，特异性84%。EPCA有EPCA2.19和EPCA2.22两个亚型。EPCA2.19的界值为0.5ng/mL时，前列腺癌诊断敏感性为93%，特异性100%；EPCA2.22的界值为30ng/mL时，前列腺癌诊断敏感性为96%，特异性100%。同一组患者PSA的特异性仅为37%。EPCA2.22有助于区分局限性和非局限性前列腺癌。RM2抗原表达于前列腺癌细胞和间质，前列腺癌时有大量的RM2释放入血，因此检测血RM2有助于前列腺癌的诊断，尤其是PSA
膀胱癌的诊断和随访多年来依靠尿细胞学。尿细胞学的特异性很高(96%-100%)，但敏感性较低(38%-54%)。近年来人们从尿中找到了许多尿路上皮癌的生物标记物，如BTA在膀胱癌诊断特异性为92%，敏感性100%；NMP22的特异性77%-87%，敏感性为85%-91%；Telomerase的特异性95%，敏感性80%。此外，还有ImmunoCyt/uCyt+、solubleFas、Survivin、MMP2、MMP9、Cox2、CD24等对尿路上皮癌的诊断均有一定特异性和敏感性。其中BTA、NMP22和ImmunoCyt/uCyt+已被FDA批准作为尿路上皮癌的临床应用。研究发现膀胱癌组织中高表达XIAP、MDR1等与化疗耐药密切相关，这对于判断膀胱癌化疗耐药或逆转耐药的研究奠定了基础。对于尿路上皮癌，这些生物标记物取代尿细胞学而应用于临床，仍有待于提高它们的特异性或寻找更具有尿路上皮癌特异性的生物标记物。
5我国在泌尿系肿瘤基础研究中存在的问题
医学基础研究在中国与美国和欧洲相比有着一定的差距，包括在泌尿系肿瘤的基础研究。归纳起来，在我国基础研究还存在以下几个问题：
5.1缺乏系统性和连续性医学基础研究是根据某种生物现象或临床出现的问题进行探索，研究其发生的原因和过程，并解决问题，即所谓“还原因果”。解决某个生物现象或临床问题需要连续不断的系统性研究，单纯追求时髦或盲炒热点，“打一枪换一个地方”不仅不能“还原因果”，解决实际问题，反而造成极大的浪费。因此，一个好的实验室或一个好的课题组的研究方向应该高度集中，研究内容具有系统性和连续性。
5.2缺乏创新性科学技术的发展日新月异，许多创新性的研究不断涌现。但是，通过国内许多申请的科研项目和发表的大量文章来看，存在着对创新性的认识偏差：①认为别人没有做过的科研工作就是创新性的工作。创新性的科学研究应该是不仅具有新颖性(即他人没有做过的工作)，更重要的是具有突破性的思想和工作；②移植工作。认为在其他肿瘤中研究过，但在某一肿瘤中没人做过。这种情况如果对某一肿瘤具有独特的相关性，可能会得到突破性结果，但绝大多数情况属于重复工作。
5.3重复工作设计一个科研项目需要充分了解国内国际在该领域的研究现状，设计出具有创新性课题，避免重复工作。在中国因条件限制医学基础研究多年来落后于美国和欧洲，多数情况下属于追随科学。另外，因急于发表文章，急于求成或为发表文章而做科研，极易造成重复研究。在中国许多实验室虽然资金投入和设备条件不及欧美国家，但在中国具有大量的研究资源和人种地区的特点。从追随科学到自创科学是我们努力的方向。
5.4研究方法单一表现在通过单一研究方法(如免疫组化或原位杂交等)所得结果得出某一结论，这种情况往往是不完全或偏差的结果，也不符合科学的严谨性。研究和解释某一现象，如某一基因表达高或低，或表达改变导致下游传导通路改变和最终的生物现象的改变，应该在不同的分子水平如DNA、RNA、蛋白等水平分别研究，通过多种途径和方法证明这一现象。
5.5单纯追求新方法和技术目前存在某种偏差的认识，认为应用了新技术和方法(如siRNA、蛋白组分析、干细胞技术等)就能申请到科研项目和在好的杂志发表文章。方法和技术是为科学研究服务的工具，人们不断地研究开发新技术和新方法目的是为了更好地服务于科学研究。利用新技术和方法能更好的得到我们想要的研究结果是最终目的。
【摘要】
目的：研究不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。方法：采用共沉淀法制备得到不同粒径FeOx，将不同粒径FeOx吸附于细胞表面，并加载静磁场(SMF)及100Hz交变磁场(EMF)照射。运用CCK8检测纳米粒子吸附后在外加磁场作用下Bel7402细胞增殖情况，运用流式细胞仪检测细胞凋亡、死亡率及细胞周期变化。结果：不同粒径磁性纳米FeOx在SMF照射时间低于72h时能使Bel7402细胞增殖速度增快，当照射时间大于72h时，细胞增殖速度未发生明显变化但部分细胞发生凋亡，凋亡率为(3.1±0.78)％。而经EMF照射后37nmFeOx吸附细胞增殖被抑制，细胞周期实验结果表明大部分细胞被阻滞在G0/G1期，细胞出现大量死亡与凋亡，凋亡率达到(23.34±3.6)％、死亡率达到(57.24±2.7)％。结论：纳米粒子未有外加磁场照射时不能对细胞产生明显的影响，外加SMF照射时，细胞的增殖及DNA代谢未发生明显的变化，但细胞发生凋亡；外加EMF照射时，细胞增殖被抑制并发生明显的凋亡及死亡，细胞DNA代谢明显紊乱，且具有较小粒径的磁性纳米FeOx在EMF作用下对肝癌细胞影响最为显著。
【关键词】磁性纳米FeOx；增殖；凋亡；DNA周期
［Abstract］Objective:TostudytheeffectsofdifferentdiametersofnanoFeOxpowdersonproliferationandDNAmetabolismofheptomacelllinesBel7402.Methods：DifferentdiametersofnanoFeOxpowderswereutilizedtodopetheheptomacelllinesBel7402throughthecoprecipitationmeanings，thencellswereexposedbystaticmagneticfield(SMF)andextremelylowfrequencyalteringmagneticfield(EMF)with100Hz.Afterexposedbyexternalfields，CCK8kitwasusedtodetecttheeffectsonproliferationofcellscausedbynanopowders.ApoptosiskitandDNAcyclekitwasusedtodetecttheeffectscausedbynanoFeOxofcellapoptosis，deathandcellDNAcyclemetabolism.Results：DifferentdiametersnanoFeOxcouldnotinfluencethecellatallunderSMFexposurebutcouldinfluencethecellsunderEMF，whenthediameterwas37nmthehighestapoptosisanddeathrationwere(23.34±3.6)％and(57.24±2.7)%，respectively，andthemostofcellswereprohibitedinG0/G1periodofDNAcycle.Conclusion：nanopowderscouldnotinfluencethecellsatallwithoutexternalmagneticfieldexposure.UnderSMFexposuretheproliferationandDNAmetabolismofcellsabsorbingbynanopowderswerenotinfluenced，buttheapoptosisratioofcellswasincreased.AfterexposurebyEMFcellsabsorbingbynanopowderscouldbeaffectedinproliferation，apoptosisandDNAmetabolism，furthermore，alltheeffectsweremoreobviousinthecellsabsorbingbynanopowderswithlittlediameterunderEMFexposure.
［Keywords］magneticnanoFeOx；proliferation；apoptosis；DNAcycle
磁性纳米材料具有良好的磁导向性、较好的生物相容性、生物降解性和活性能基团等特点［1-3］，它可结合各种功能分子，如酶、抗体、细胞、DNA或RNA等，因而在靶向药物、控制释放、酶的固定化、免疫测定、DNA和细胞的分离与分类等领域可望有广泛的应用。磁性纳米材料特别是Fe属纳米颗粒已经被广泛应用于药物靶向治疗及干细胞定向移植治疗中［4］。当粒径在30～200nm之间时，矫顽力和饱和磁化强度均达到最大值，且具有单畴特性。目前已有纳米磁性氧化铁等颗粒作为药物或干细胞载体用于肝癌动物实验的研究，但对磁性纳米氧化铁粒子本体对人体研究相对较少［5］。本研究以肝癌细胞Bel7402为对象，观察不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对其生物学特性的影响，旨在为FeOx用于治疗肝癌提供实验依据。
1材料和方法
1.1试剂及仪器
肝癌细胞株Bel7402购自中国科学院上海细胞库。静磁场发生仪为两块强磁场稀有金属镍/铁永磁体，当两块磁体间距为2.5cm时其场强为0.7特斯拉（T）。TYU2002HII型特斯拉计/高斯计为上海亨通磁电科技有限公司产品。变频仪(FT1000型)为南京万臣电子有限公司产品，变压器(PT800型)为上海富济电子公司产品。胰蛋白酶、Primilar1640培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，维生素C、青霉素、链霉素为杭州四季青公司产品。CCK8试剂盒为美国ADL公司产品，细胞凋亡及周期试剂盒均购自美国BD公司。FeSO4、醋酸锌均为分析纯，购自南京化学试剂有限公司。扫描电镜(SEM)型号为HITACHIX650，X射线衍射仪(XRD)型号为PhilipsX′pertXRDsystem型。
1.2方法
1.2.1磁性纳米FeOx的制备
运用共沉淀法［5］以FeSO4及醋酸锌为反应物，反应在乙醇、水（1∶3）混合溶剂中进行并加入质量百分比为2％的甘油，制备得到醋酸亚铁前驱体，前驱体粉末灼烧温度为400℃，灼烧4h后得到FeOx粉体，10000r/min离心30min，得到上下两层不同粒径粉末，经SEM及XRD实验确定其粒径及成分组成。SEM实验前样品用超声清洗仪超声分散10min。XRD实验条件为：扫描速率为2θ/min，测定纳米粉体XRD谱。
1.2.2磁性纳米FeOx吸附细胞实验
将不同粒径纳米FeOx加入到细胞培养瓶中与细胞共同培养。纳米粒子吸附细胞方法为：将细胞消化成细胞悬液并调整细胞浓度大于105个/ml，再将不同粒径纳米粒子加入到细胞悬液中并在恒温摇床中匀速振荡30min，摇床摇速为200r/min。振荡完成后将细胞置于细胞培养箱中培养。细胞培养2d后经SEM实验确定磁性纳米FeOx结合效率。
1.2.3细胞培养
细胞种植到含10％FBSPIMIRIER1640培养基的培养瓶，放置在37℃，5％CO2培养箱持续培养。细胞传代时用胰蛋白酶消化细胞成细胞悬液，磷酸盐缓冲液（PBS）1500r/min15min离心洗涤2次，用含10％FBS1640培养基重悬细胞后种植细胞，每次细胞种植浓度应大于105个/ml。细胞临时保存在-70℃超低温冰箱，永久保存在液氮罐中，细胞冻存液配比为DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1(体积比)，细胞冻存浓度应高于106个/ml。
1.2.4磁场照射细胞方法
静磁场(SMF)照射细胞方法为：将细胞培养瓶置于两块永磁体之中，同时置于细胞培养箱中培养，每间隔12h照射1次，每次照射30min，直至84h。100Hz交变磁场(EMF)照射细胞方法为：将细胞培养瓶置于离工作线圈顶端2cm，经特斯拉计测量磁感应强度为0.67mT，每间隔4h照射1次，每次照射30min，直至40h。照射完成后，细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液进行各种检测。
1.2.5CCK8细胞增殖实验
按试剂盒提供实验方法进行。首先取出96孔酶标板，依照次序对应分别加入50μl的标准品于酶标板微孔中，分别标记样品编号，将50μl细胞培养悬液（2.5×104个/ml）加入到酶标板中；在标准孔和样品孔中加入100μl的酶标记液，36℃孵育1h，将溶液倾出，PBS清洗5次后每孔加入底物A，B液各50μl，36℃下避光孵育反应15min后加入终止液50μl，终止反应。测定450nm的光密度值。每隔12h重复进行以上步骤，72h得到细胞增殖数据绘制细胞增殖曲线。
1.2.6细胞凋亡、死亡及周期实验
细胞凋亡及周期实验均在流式细胞仪上完成，均按试剂盒提供实验方法进行。凋亡实验方法为：将细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液，并用PBS洗涤2次并将细胞浓度重悬调整为106个/ml。染色过程为首先用微量移液枪移取20μl细胞悬液，然后用AnnexinV加入到细胞悬液中并避光静置15min后将PI染料加入并静置30min，染色完成后上机实验。细胞周期实验方法为：首先按凋亡实验相同方法处理细胞以待上机检测，染色方法为将试剂盒内A，B，C，D4种试剂按顺序分别加入到细胞悬液中，避光静置时间均为15min。染色完成后上机实验。流式细胞仪实验条件为：细胞进样流速中速，前向角补偿电势为56V。
1.2.7统计分析
实验结果用±s表示，使用SPSS13.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。
2结果
2.1纳米FeOx表征实验结果
SEM及XRD实验结果表明两种粒子的平均粒径分别为37，70nm左右，粒子形状为不规则球形（图1，2）。根据Scherrer公式：D=Kλ/βcosθ，其中D为粒子粒径，K为形状因子，λ为X衍射的波长，β为衍射峰的半峰宽，θ为衍射角。经XRD实验结果证明粒子中Fe，O两种元素的比例为1∶1.12。图3为2种FeOx与Bel7402细胞吸附情况，图中FeOx为黑色颗粒，FeOx与Bel7402细胞发生了较为明显的吸附，37nm粒子更易于在细胞表面吸附，表现为每个细胞表面吸附粒子数量明显增加。
(a)37nmFeOx(×30000倍）(b)70nmFeOx(×10000倍)
2.2细胞增殖实验结果
不同粒径纳米FeOx在未经磁场照射时并未对细胞增殖产生明显的影响，细胞经SMF照射其增殖在磁场照射初期速度变快，当照射时间超过72h后增殖未发生明显改变(相对对照组)。经EMF照射后两种粒子吸附细胞的增殖均被抑制，当EMF照射时间为5h时细胞增殖抑制率达到最大，37nmFeOx抑制率达到（76.31±2.3）％，70nmFeOx抑制率为（53.56±5.2）％。
2.3细胞凋亡及死亡实验结果
从表1可见，凋亡率、死亡率3组间比较差异无统计学意义，说明未经磁场照射的纳米粒子不能导致细胞死亡及凋亡。表2可见37nm和70nmFeOx吸附细胞经SMF照射达到60h后，细胞发生凋亡，当照射时间为72h时37nmFeOx吸附细胞的凋亡率为（3.13±0.78）％，70nmFeOx吸附细胞的凋亡率仅为（1.25±0.23）％。而未经磁场照射37nmFeOx吸附细胞的凋亡率为（0.01±0.03）％，70nmFeOx吸附细胞的凋亡率为（0.02±0.04）％，未经FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.01±0.02）％。表137nm和70nmFeOx吸附细胞自然生长凋亡率及死亡率，Tab1ApoptosisanddeathrationofBel7402absorbedbydifferentdiametersnanoFeOx（略）；表237nm和70nmFeOx吸附细胞经SMF照射细胞凋亡率及死亡率，Tab2ApoptosisanddeathrationofBel7402absorbedbydifferentdiametersnanoFeOxexposedbySMF（略）。
表3表明随着EMF照射时间的延长，细胞凋亡率随之增加，当照射时间达到5h时其凋亡率最大，37nmFeOx吸附细胞的凋亡率为（23.34±3.6）％，死亡率（57.24±2.7）％。而70nmFeOx吸附细胞的凋亡率为（12.54±6.7）％，死亡率为（37.28±4.2）％。当照射时间超过5h后，细胞凋亡率增速变慢。表337nm和70nmFeOx吸附细胞经EMF照射凋亡率及死亡率，Tab3ApoptosisanddeathrationofBel7402absorbedbydifferentdiametersnanoFeOxexposedbyEMF（略）
2.4细胞周期实验结果
从表4可见，37nm和70nmFeOx吸附细胞自然生长细胞周期，与未经处理Bel7402细胞作比较，无统计学意义，与凋亡实验结果相符，表明FeOx吸附细胞并不能影响细胞周期代谢。表5表明当细胞被纳米粒子吸附并在外加SMF照射下细胞DNA代谢未发生紊乱，在SMF照射初期细胞处于S，G1期细胞比例增加，细胞增殖变快，与细胞增殖实验结果吻合，当照射时间超过72h后细胞处于G0期含量增加，细胞进入增殖静止期。凋亡实验结果表明此时细胞发生明显的凋亡，表明细胞凋亡通路被激活，细胞增殖可能被抑制。表437nm和70nmFeOx吸附细胞自然增殖细胞周期实验结果，Tab4ProliferationresultsofBel7402absorbedbydifferentdiametersnanoFeOx（略）；表537nm和70nmFeOx吸附细胞经SMF照射细胞周期实验结果，Tab5ProliferationresultsofBel7402absorbedbydifferentdiametersnanoFeOxexposedbySMF（略）。
表6表明，37nm和70nmFeOx吸附细胞在外加EMF作用下，细胞DNA代谢均发生明显变化，细胞周期中G0/G1值增加，照射5h时37nm粒子吸附细胞值为（91.6±1.3）％，而70nm粒子吸附细胞值为（63.5±2.4）％，细胞增殖被抑制。表637nm和70nmFeOx吸附细胞经EMF照射细胞周期实验结果，Tab6ProliferationresultsofBel7402absorbedbydifferentdiametersnanoFeOxexposedbyEMF（略）。
3讨论
磁性纳米材料已经被用作药物或干细胞的载体用于各种疾病的靶向治疗［6］，但现有研究多集中于纳米粒子与药物或干细胞的吸附研究，对磁性纳米粒子本体在外加磁场作用下对细胞或生物体影响的研究较少，本研究即以磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞Bel7402的影响为研究对象。
我们采用共沉淀法制备得到的纳米FeOx粒子的平均粒径分别为37nm及70nm且粒径分布均匀。粒子形状为不规则球形，XRD实验结果表明粒子的表面有较多的空间位隙，导致粒子中两种元素的化学计量比不规则，其Fe与O计量比为1∶1.12。已有研究表明具有晶格缺陷的纳米粒子更容易吸附小分子物质或更容易吸附在其他物质表面［7］，本文合成得到的纳米粒子具有较多的晶格缺陷，实验用纳米FeOx较易在细胞表面发生吸附。
细胞增殖实验表明，37nm和70nmFeOx吸附在细胞表面后在SMF照射条件下，细胞增殖速度在照射初始阶段增加，当照射时间超过72h后细胞发生凋亡，但增殖速度未发现明显变化，可能由于FeOx吸附细胞后在SMF照射条件下更易沉降到细胞培养瓶底部。纳米FeOx并不能影响细胞的正常分裂与增殖，同时SMF照射细胞也不能引起细胞发生改变，与文献报道结果类似［8］。EMF照射细胞能抑制细胞增殖，细胞增殖时间明显延长，当EMF照射时间达到5h后，EMF照射FeOx吸附细胞抑制达到最大。比较两种FeOx吸附细胞在EMF照射条件下细胞增殖结果可以得出，37nmFeOx粒子对细胞的增殖抑制更为显著，表明纳米FeOx在EMF照射下能很好地抑制肝癌细胞的增殖。
EMF照射细胞本身能影响细胞的增殖，导致细胞早期凋亡以及细胞DNA代谢发生紊乱和DNA双链断裂［9］。本研究表明，纳米粒子吸附到细胞表面后在外加EMF作用条件下这种影响更为明显，具有更小粒径的FeOx在EMF作用下对细胞凋亡的影响更为显著。同时，随着EMF照射时间增加，FeOx吸附的细胞DNA代谢发生紊乱，大部分细胞被阻滞在G0/G1期，同时处于S期的细胞含量减少，表现为明显的S期和G2期阻滞。
纳米粒子在吸附到细胞表面后可一定限度地改变细胞表面电势，EMF同样能改变细胞表面的电势而导致细胞发生凋亡等生理现象［9，10］。两种外加因素对细胞的影响有明显的叠加效果，纳米FeOx在外加EMF作用下发生明显的振荡现象能较大程度改变细胞膜表面的电势分布，从而改变Na+，K+，Ca2+等离子通过细胞膜表面的速度和方向，Ca2+代谢与细胞的凋亡相关，Na+，K+与细胞死亡和DNA代谢相关［10］。同时，纳米FeOx在磁场作用下发生振荡能导致明显的热效应［11］，导致细胞发生凋亡或死亡以及导致细胞DNA发生明显的代谢紊乱。37nmFeOx在外加EMF作用下对Bel7402的影响更为明显，在EMF作用下振荡更为剧烈［12］。
综上所述，不同粒径磁性纳米FeOx吸附在细胞表面并不能影响细胞的增殖，也不能导致细胞发生凋亡或DNA代谢紊乱；在SMF照射时，在磁场照射初期能提高吸附有纳米粒子的细胞增殖速率，当照射时间达到72h时能导致细胞发生凋亡；在EMF照射时，吸附有纳米FeOx细胞的凋亡及死亡率急剧变大，表明磁性纳米粒子与EMF对细胞的作用有叠加效果，具有较小粒径的纳米FeOx在EMF作用下对细胞的影响更为剧烈。磁性纳米FeOx在外加EMF作用下能很好地抑制细胞的增殖。对纳米粒子在细胞表面的吸附率、与细胞的融合以及对细胞膜表面电势的影响及热效应还需进行更为深入的研究。
参考文献
［1］XuJ，YangHB，FuWY.Preparationandmagneticpropertiesofmagneticnanoparticlesbysolgelmethod［J］.JMagnMagnMater，2007，309(1):307-311.
［2］ViotaJL，DuránJDG，GonzálezCaballeroF，etal.Magneticpropertiesofextremelybimodalmagnetitesuspensions［J］.JMagnMagnMater，2007，314(2):80-86.
［3］HongRY，PanTT，HanYP，etal，MagneticfieldsynthesisofFe3O4nanoparticlesusedasaprecursorofferrofluids［J］.JMagnMagnMater，2007，310(3):37-47.
［4］CarpenterEE.Ironnanoparticlesaspotentialmagneticcarriers［J］.JMagnMagnMater，2001，225(1):17-20.
［5］QuYQ，YangHB，YangN，etal.Theeffectofreactiontemperatureontheparticlesize，structureandmagneticpropertiesofcoprecipitatedCoFe2O4nanoparticles［J］.MaterLett，2006，60(29/30):3548-3552.
［6］DavidR，PeterA，EricD，etal.Dermatancarriersforneovasculartransporttargeting，deeptumorpenetrationandimprovedtherapy［J］.JControRel，2005，109(1/3):222-235.
［7］YoshitsuguK，YasuakiK，TetsuyaH.Magnesiumbasednanocompositematerialsforhydrogenstorage［J］.JAllCom，2006，424(1/2):294-298.
［8］LiF，XuKW，WangHC，etal.Effectsofstaticmagneticfieldonhumanumbilicalvesselendothelialcell［J］.JMedCollePLA，2007，22(2):106-110.
［9］阮晓声，梁中庆，张月芳，等.恒磁场环境对大鼠血液流变学特性的影响［J］.中华理疗杂志，2000，23(4):218.
［10］KoelschP，ViswanathP，MotschmannaH，etal.Specificioneffectsinphysicochemicalandbiologicalsystems:Simulations，theoryandexperiments［J］.ColloidsSurA，2007，303（1/2）:110-136.
“幽灵”细胞，始作俑者
多年来，不少科学家对肿瘤的发生、发展机制进行了长期的研究，试图找出能彻底治愈肿瘤的方法。近年来，“肿瘤干细胞理论”的提出为肿瘤的彻底治愈带来了一线希望。该理论已经被大量的实验所证明。这一理论认为，在肿瘤组织中存在着肿瘤干细胞，这种干细胞虽仅占肿瘤细胞的万分之一至百分之一左右，但具有强大的分裂能力，能产生不同分化程度的肿瘤细胞，在维持肿瘤的恶性繁殖、转移和复发等方面起着决定性的作用，也是肿瘤传统治疗，尤其是化疗失败的“罪魁祸首”。除此以外，近年来关于肿瘤的复发还有一种观点，那就是过度的化疗导致了肿瘤复发。这一理论的基础也在于对肿瘤干细胞生物学行为的观察。肿瘤干细胞不同于普通肿瘤细胞，由于它们平时处于“休眠”状态，传统的化疗药物“打击”的是快速生长的普通肿瘤细胞，但对肿瘤干细胞却奈何不了。然而，在化疗药物杀伤它的“子孙”――成熟的肿瘤细胞后，这些平时处于“休眠”状态的肿瘤干细胞就被唤醒了，导致肿瘤复发，最终导致治疗失败和病人死亡。
1997年，加拿大多伦多大学分子遗传学部的多米尼克•波尼特（DominiqueBonnet）第一次从白血病患者体内找到了肿瘤干细胞，这种细胞虽只占白血病细胞的1%，但它们却可以在小鼠体内（这种实验小鼠对外来异样细胞没有免疫力）诱发产生与人体内相似的肿瘤。相反的，把其他99%的肿瘤细胞大量接种在小鼠体内，肿瘤却没有生长。这是人类第一次发现肿瘤细胞中不同类型细胞具有不同的行为。2003年，美国密歇根大学的迈克尔•克拉克（MichaelClarke）等首次在实体瘤（乳腺癌）中证明存在肿瘤干细胞。他们根据不同的细胞表面蛋白，将从人体乳腺癌中得到的肿瘤细胞分为两类，然后分别移植到小鼠体内。结果发现，其中一类数量较多的癌细胞，即使移植100万个也不能形成新的肿瘤；而另一类占总量很少比例的癌细胞，却只需500个就可以在小鼠体内生成新的肿瘤，这就是所谓的“肿瘤干细胞”。这两个实验结果的公开发表，极大地推动了肿瘤干细胞的研究，短短几年内，在脑肿瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌和黑色素瘤等多种实体瘤中均发现了肿瘤干细胞。至此，这种“幽灵”一样的细胞终于现出了原形！
顽固不化，死灰复燃
相对于正常细胞，培养的肿瘤干细胞大多呈多角形，形态大小不均，细胞核很大，核浆比例倒置，细胞核仁清晰，细胞器排列较乱。肿瘤干细胞与正常干细胞之间存在极大的相似性，如细胞的信号传导通路（人体中，信号传导通路通常是由分泌释放信息物质的特定细胞、信息物质以及靶细胞等构成）、细胞膜表面分布的蛋白质分子、细胞的分裂繁殖方式等。因此，大多数科学家认为肿瘤干细胞起源于正常干细胞，是一种“误入歧途”的干细胞。正常干细胞在致癌因素的作用下，发生遗传学改变，突变成肿瘤干细胞。肿瘤干细胞在“苏醒”后有对称分裂和不对称分裂两种分裂方式：对称分裂（左页图中箭头①②）即一个肿瘤干细胞分裂产生两个完全相同的子代肿瘤干细胞；不对称分裂（左页图中箭头③④）即一个肿瘤干细胞可分裂形成一个与自身完全相同的肿瘤干细胞和一个子代分化型的成熟肿瘤细胞。这个子代的成熟肿瘤细胞就可以继续快速地分裂增殖并发育成为肿瘤组织。这种分裂方式一方面维持肿瘤干细胞库的稳定，另一方面分化产生大量肿瘤细胞，维持肿瘤的生长。
肿瘤干细胞既是肿瘤发生的起始细胞（致瘤性），也是肿瘤转移的“种子”细胞（转移性）。在细胞内多种活性分子帮助下，肿瘤干细胞失去上皮细胞的特征，与周围细胞和基质的黏附能力下降，而获得迁移性和很强的运动能力。在经过血液途径、淋巴途径转移到远处后，在合适的环境沉积下来继续进行上述变化，进而在人体其他部位生长繁殖形成与原发的肿瘤灶性质相同的肿瘤转移灶。
肿瘤干细胞的存在也是肿瘤常规治疗后复发的根源所在。与正常干细胞类似，肿瘤干细胞具有较强的自我保护机制。除了静止休眠状态下对化疗药物不敏感之外，肿瘤干细胞还能通过其细胞膜上的转运装置“泵出”对自身有害的化疗药物。更可怕的是肿瘤干细胞还可通过其内部增强的“抗衰老”能力和损伤修复能力来逃避放化疗对它的攻击。因此传统的放化疗很难将其杀死，体内残留的极微量的肿瘤干细胞就足以导致肿瘤的复发。这就是病人经过彻底的放化疗若干年后还是发生全身转移的根本原因。
有的放矢，靶向治疗
为了杀死顽固的肿瘤干细胞，摧毁肿瘤的“新兵源”，需要针对肿瘤干细胞的特性，在不损害机体正常干细胞的前提下，制定出个体化的治疗方案。目前主要有以下几种可能的途径，有望在未来应用于临床，提高肿瘤治疗的疗效。
1．针对肿瘤干细胞表面特异性的蛋白分子（抗原），制备出特异性的抗体药物，靶向杀死肿瘤干细胞；
2．面向肿瘤干细胞内的信号传导通路，对通路上的相关分子进行特异性抑制，阻断信号传导通路，抑制肿瘤干细胞的自我更新；
3．扰乱肿瘤干细胞赖以生存的微环境，选择性地抑制肿瘤干细胞的生长，从而抑制肿瘤生长；
4．从肿瘤干细胞的耐药机制入手，抑制细胞膜上转运蛋白的活性，增强其对化疗药物的敏感性；
5．针对肿瘤干细胞内高度活化的端粒末端转移酶（其功能是延长端粒，保护染色体，能延缓细胞死亡，是控制细胞寿命的关键因素），特异性抑制端粒酶的活性，抑制肿瘤干细胞的生长和繁殖，从而达到抑制肿瘤的目的；
6．诱导肿瘤干细胞的分化，使其从休眠状态进入细胞分裂状态，恢复其对化疗药物的敏感性。
一、教学目的要求
(一)要求学生比较系统地掌握关于细胞、生物的新陈代谢、生物的生殖和发育、生命活动的调节、遗传和变异等方面的基础知识，以及这些知识在农业、医药、工业、国防上的应用。
(二)通过生物学基础知识的学习，使学生受到辩证唯物主义和爱国主义思想的教育。
(三)要求学生掌握使用高倍显微镜，做简单的生理实验等的基本技能。
(四)培养学生自学生物学知识的能力，观察动植物的生活习性、形态结构、生殖发育的能力，分析和解释一些生物现象的初步能力。
二、确定教学内容的原则
(一)从学生今后进一步学习和参加社会主义现代化建设的需要出发，认真选取生物学基础知识：选取生物的结构和生理的知识。结构知识是理解生理知识的基础。生理知识是阐明生物的新陈代谢，生长、发育和生殖等的基础知识。因此，必须重视选取形态结构和生理的知识。
(二)选取生物学基础知识，必须做到理论密切联系实际。
1.选取生物学基础知识，要密切联系工农业生产实际。生物学是农业、畜牧业和医学等方面实践的理论基础，通过学习生物学知识，要使学生知道生物与生产的关系十分密切，应该利用和改造有益的生物，防除有害的生物。
2.要密切联系各地的自然实际。由于我国幅员广大，各地的生物种类有很大差别。因此，所选取的植物和动物，既要重视其典型性，又必须尽可能是各地比较常见的，以便学生可以直接观察到这些动植物和了解这些动植物的生活规律。
3.选取的生物学基础知识，要密切联系学生的日常生活实际，使学生加深对生物学知识的理解，同时更加深刻地认识学习生物学的意义。
(三)适当选取反映现代生物科学水平的生物学基础知识。
现代生物科学发展很快，生物课必须重视用现代生物科学的观点来阐述教学内容，并且适当地增加反映现代生物科学水平的知识内容，使学生对生物科学发展的现状有个初步的认识，为他们进一步学习现代生物科学知识和参加工农业生产打下必要的基础。
三、班级现状分析
本学期我任教高二（2）、（3）、（4）三个班级，三个班级人数分别为：46、45、46人，虽然通过班主任，我对个班的现状有了一点了解，但由于生物是从高二开始的起始课程，所以具体情况还不能下定论。
四、教学进度安排
高中阶段学习的生物学知识，是在初中生物教学内容的基础上进行的，学习生物的基本特征，侧重于生命活动的共同规律的内容。主要包括细胞、新陈代谢及其调节、生殖和发育、遗传和变异的知识。初中和高中两个阶段所学的生物学基础知识，既有所分工、又互相衔接，高中生物学是初中生物学知识的综合、概括和提高。
高中二年级开设的生物必修课（第一学期），每周2课时，共计34课时。讲述细胞、生物的新陈代谢、生物的生殖和发育、生命活动的调节、遗传和变异等生物学基础知识。
五、教学内容及其课时安排
高中生物必修课教学进度
单元
知识
学生实验
课时
要点
教学要求
项目
绪论
生物的基本特征
生物科学的新进展
高中生物课学习的要求和方法
b
a
a
2
生命的物质基础
组成生物体的化学元素
组成生物体的化合物
b
c
实验：显微镜的结构和使用；生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定。
2+1+1
生命的基本单位-细胞
细胞主要的亚显微结构和功能
细胞周期
细胞分裂
b
c
a
实验：
1．颤藻和水绵细胞的比较观察
2．植物细胞的有丝分裂。
生物的新陈代谢
光合作用的发现，光合作用及其重要意义
根对水分的吸收和利用
植物的矿质营养
动物的营养
呼吸作用
a
b
b
b
b
实验：
1．叶绿体色素的提取和分离
2．植物细胞的质壁分离与复原。
2+5
应激性和生命活动的调节
植物生命活动的调节
高等动物的激素调节
高等动物的神经调节
a
a
b
1+1+2
生殖和发育
减数分裂和配子的形成
a
2
具体教学内容如下：
绪论
生物的基本特征(细胞结构，新陈代谢，生长现象，应激性，生殖和发育，遗传和变异，生物与环境的相互影响)的概述。
生物学的研究对象和发展方向。学习生物学的重要意义。
说明：生物学的研究对象和发展方向，只要求学生作一般了解。
一、细胞
细胞的发现。细胞学说。原生质的概念。
细胞的化学成分：水，无机盐，糖类，脂类，蛋白质，核酸；上述物质特别是蛋白质和核酸的重要作用，构成细胞的化学元素。
细胞的结构和功能：原核细胞和真核细胞的区别。真核细胞的亚显微结构——细胞膜，细胞质(其中含有线粒体、质体、内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器)，细胞核(核膜、核仁、核液和染色质)。细胞各个组成部分的功能。一个细胞是一个有机的统一整体。细胞的分裂：无丝分裂。有丝分裂——细胞周期；细胞的分裂期分为前期、中期、后期、末期，各个分裂期的细胞核结构变化的特点。动物细胞和植物细胞的有丝分裂过程的异同。有丝分裂的重要意义。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂。
〔实验〕用高倍显微镜观察植物细胞的有丝分裂，初步学会使用高倍显微镜。
说明：在《细胞》中，以下内容只要求学生作一般了解。
1.细胞的发现，细胞学说，原生质的概念。
2.内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器。一个细胞是一个有机的统一整体。
3.无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式有有丝分裂。
二、生物的新陈代谢
新陈代谢的概念。同化作用和异化作用的概念。
绿色植物的新陈代谢：水分代谢——细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水；细胞在形成液泡以后主要靠渗透吸水。渗透吸水的原理。渗透作用的概念。质壁分离和质壁分离复原。水分散失的方式和意义。
矿质代谢——植物需要的元素(大量元素和微量元素)。根吸收矿质元素的过程——交换吸附。植物对离子的选择吸收。矿质元素的利用。
光合作用——光合作用的重要意义。高等植物叶绿体中的色素及其作用。光合作用的过程(光反应，暗反应)。atp(三磷酸腺苷)的简式，atp与adp(二磷酸腺苷)的相互转变。
呼吸作用——呼吸作用与光合作用的本质区别。呼吸作用的生理意义。呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。
动物的新陈代谢：体内细胞的物质交换——单细胞动物与外界环境直接进行物质交换；多细胞动物(如哺乳动物)的体内细胞通过内环境与外界环境间接进行物质交换。
物质代谢——食物的消化(单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。哺乳动物的消化过程概述)。营养物质的吸收(小肠在形态结构上适于吸收的特点，营养物质的吸收过程)。物质代谢的过程(糖类代谢、蛋白质代谢的过程概述)。
能量代谢——气体交换(单细胞动物和多细胞高等动物进行气体交换的特点)。能量的释放、转移和利用。高等动物在缺氧状态下通过无氧呼吸获得能量。
新陈代谢的基本类型：同化作用的两种不同类型(自养型、异养型的概念和特点)。异化作用的两种不同类型(需氧型、厌氧型的概念和特点)。
〔实验〕(1)观察植物细胞的质壁分离和复原。
(2)观察根对矿质元素离子的交换吸附现象。
(3)叶绿体中色素的提取和分离。
说明：1.在《生物的新陈代谢》中，以下内容只要求学生作一般了解。
(1)细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水。渗透吸水的原理。*渗透作用的概念。
(2)根吸收矿质元素的过程——交换吸附。
*(3)植物对离子的选择吸收。
(4)呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。
(5)单细胞动物与外界环境直接进行物质交换。
(6)单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。
三、生命活动的调节(4∶0)
植物生命活动的调节：生长素的发现。植物的向光性和向光性形成的原因。生长素的生理作用及其在实践上的意义。
动物生命活动的调节：高等动物的激素调节(甲状腺激素、性激素、生长激素的分泌部位和生理作用)。昆虫的激素调节(内激素、外激素的分泌部位和生理作用，昆虫激素在生产上的应用)。神经调节(神经系统的调节功能)。≤第一范文网整理该文章，版权归原作者、原出处所有≥
说明：在《生命活动的调节》中，以下内容只要求学生作一般了解。
*1.生长素的发现。
*2.昆虫的激素调节。
四、生物的生殖和发育(9∶0)
生物的生殖。生殖的概念。
生殖的种类：无性生殖(分裂生殖，孢子生殖，出芽生殖，营养生殖)；有性生殖(配子生殖中的卵式生殖)。这些生殖方式的特点和概念。
减数分裂与有性生殖细胞的成熟：减数分裂的概念和意义。的形成过程。卵细胞的形成过程。受精作用的概念和意义。
生物的发育。发育的概念。
植物的个体发育(以荠菜为例)：胚的发育过程，胚乳的发育过程。
动物的个体发育(以蛙为例)：胚的发育过程(包括卵裂、囊胚、原肠胚各期)，各种组织、器官和系统的形成。胚后发育。胚的发育与环境的关系。
说明：在《生物的生殖和发育》中，以下内容只要求学生作一般了解。
*1.生殖的种类。
*2.无性生殖和有性生殖方式的特点和概念。
*3.植物的个体发育(以荠菜为例)。
1.在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：
（一）生命的基础
细胞的化学成分——水，无机盐，糖类，脂类，蛋白质，核酸；上述物质特别是蛋白质和核酸的重要作用，构成细胞的化学元素。
原核细胞和真核细胞的区别。真核细胞的亚显微结构——细胞膜，细胞质(其中含有线粒体、质体)，细胞核(核膜、核仁、核液和染色质)。细胞各个组成部分的功能。
有丝分裂——细胞周期；细胞的分裂期分为前期、中期、后期、末期，各个分裂期的细胞核结构变化的特点。动物细胞和植物细胞的有丝分裂过程的异同。有丝分裂的重要意义。
2.在高中二年级生物课中作为一般了解的以下教学内容，要求达到掌握：
内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器。一个细胞是一个有机的统一整体。
无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂。
3.〔实验〕用高倍显微镜观察植物细胞的有丝分裂，学会使用高倍显微镜。
(二)生物的新陈代谢(5∶2)
1.在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：
新陈代谢的概念。同化作用和异化作用的概念。
细胞在形成液泡以后主要靠渗透吸水。质壁分离和质壁分离复原。水分散失的方式和意义。植物需要的元素(大量元素和微量元素)。矿质元素的利用。
光合作用的重要意义。高等植物叶绿体中的色素及其作用。光合作用的过程(光反应、暗反应)。atp(三磷酸腺苷)的简式，atp与adp(二磷酸腺苷)的相互转变。
呼吸作用与光合作用的本质区别。呼吸作用的生理意义。
多细胞动物(如哺乳动物)的体内细胞通过内环境与外界环境间接进行物质交换。
哺乳动物的消化过程概述。营养物质的吸收(小肠在形态结构上适于吸收的特点，营养物质的吸收过程)。物质代谢的过程(糖类代谢、蛋白质代谢的过程概述)。
气体交换(单细胞动物和多细胞高等动物进行气体交换的特点)。能量的释放、转移和利用。高等动物在缺氧状态下通过无氧呼吸获得能量。
3.在高中二年级生物课中作为一般了解的以下教学内容，要求达到掌握：
细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水。渗透吸水的原理。
根吸收矿质元素的过程——交换吸附。
呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。单细胞动物与外界环境直接进行物质交换。
单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。
4.〔实验〕(1)观察植物细胞的质壁分离和复原。
(2)观察根对矿质元素离子的交换吸附现象。
(3)叶绿体中色素的提取和分离。
(三)生命活动的调节(2∶0)
在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：
植物的向光性和向光性形成的原因。生长素的生理作用及其在实践上的意义。
【摘要】目的：观察阿霉素长时间作用对胆管癌细胞株FRH0201生物学活性的影响。方法：用2μg/ml的阿霉素同一浓度逐渐延长时间作用于人胆管癌细胞株FRH0201细胞，经反复作用筛选出能在含1μg/ml的阿霉素培养液中生存72h，去掉阿霉素后仍能继续稳定传代生长的细胞。无药培养1月后进行生物学行为的监测。观察细胞形态学，绘制生长曲线和流式细胞仪测定细胞周期，酶联免疫吸附法测定细胞的肿瘤标记物，激光共聚焦显微镜观察细胞内的阿霉素的荧光强度。结果：阿霉素作用后FRH0201细胞形态学有轻度改变，细胞倍增时间较亲本细胞延长3h，与亲本细胞相比S期细胞增多16.89%，G1期细胞减少29.33%、G2期细胞增多12.46%。CA125和CA199试验组和亲本组分别为9.14和8.60U/ml，1.59和2.96U/ml，细胞内阿霉素浓度（荧光强度平均值），亲本细胞为1764.8，试验组细胞为305.4。结论：阿霉素对胆管癌细胞株FRH0201的形态学及倍增时间无明显影响，但使细胞进入S期、G2期的增多，细胞内药物浓度明显降低，生长时间无明显变化。
【关键词】胆道肿瘤・阿霉素・肿瘤细胞，培养液・细胞周期・细胞大小・CA125・CA199
TheeffectsofadramycinonthehumanliverhilarcholangiocarcinonacelllineFRH0201
【ABSTRACT】Objective:ToinvestigatetheeffectsofadramycinoncelllineofFRH0201.Methods:Humanhilarcholangiocarcinonacelllinewereculturedwithadramycin(2μg/ml)throughlastingdifferenttimes，finallythiscelllinecansurviveafter72hculturedinthecultureliquidwiththeadramycin(1μg/ml).Thenthemediumwasreplacedwithafreshonewithoutadramycin，andthecellswerecontinuouslyculturedfor1month.Theinvitrostudiesincludedtheobservationoftheappearancewithopticalmicroscope，MTTcellproliferationassay，analysisofthecellcyclebyFlowcytometry(FACS)，assaysoftumormarkerusingenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)，thefluorescencedensityofadramycin.Results:ComparedtotheparentFRH0201cellline:Themorphologyshowedtypicalmorphologicalcharacteristics，thedoublingtimeprolongedabout3h，thecellcyclebyflowcytometryidentifiedinG1，G2andSphaseofcellcyclewere40.50%，19.74%and39.77%intrialgroup，and69.83%，7.29%and22.88%inparentgroup，respectively.Tumormarkerhasnodifferencebetweenthem，thefluorescencedensityofepirubicindescending5.2times.Conclusion:Theadramycincanaffectthecellcycleandcausethechangeofmetabolism.
【KEYWORDS】Biliarytractneoplasms・Adramycin・Tumorcells，cultured・Cellcycle・Cellsize・CA125・CA199
目前，肝门部胆管癌手术切除率已明显提高，手术病死率明显下降，但真正达到根治性切除的病例很少，局部复发率很高，现有的化疗及放疗未见明显的效果。其原因可能与肝门部胆管癌的生物学特性有关［1］。为此，我们观察阿霉素长时间作用对胆管癌细胞株FRH0201生物学活性的影响。
1材料和方法
1.1材料阿霉素购于深圳万乐公司，MTT购自爱博生物工程有限公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。胆管癌细胞株FRH0201由本课题组吴小鹏教授构建［2］。
1.2方法采用浓度相同不断增加作用时间的方法确定阿霉素培养液终浓度为1μg/ml。首先分别向FRH0201细胞株的培养瓶内加入不同浓度的阿霉素（Adramycin，ADR），培养3d后观察细胞死亡情况。结合阿霉素的血浆浓度，选择可将50%的细胞抑制的药物浓度（IC50）作为耐药细胞培养的起始浓度（2μg/ml），将肿瘤细胞置于该培养液中和不含药物的10%小牛血清RPMI1640培养液培养，待细胞稳定生长、进入对数生长期后，传代两次，再将筛选出的细胞在相同药物浓度培养液中继续培养。经过1，2，3，6，12，24，36，48，60，72h10个时间段约8个月的培养，最终使细胞能够在1μg/ml阿霉素培养液中持续稳定生长并传代，然后脱药培养1个月在检测细胞的生物特性。
1.3观察指标
1.3.1形态学观察将两株细胞分别爬片后经HE染色，光镜下进行形态学观察。
1.3.2细胞倍增时间的测定取对数生长期的亲本细胞即未用药的细胞和阿霉素作用的细胞与试验组细胞各一瓶，0.25%胰蛋白酶消化，10%小牛血清1640培养液制成浓度为1×104个/ml的单细胞悬液，96孔板中每孔接种200μ1，37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养。每天取3个复孔计数活细胞，计算平均值，连续观察7d。以培养时间为横轴，以细胞数的对数为纵轴，绘制半对数细胞生长曲线，于生长曲线上对数生长期内取3组数据，根据最小二乘法进行直线回归，在直线上任取两点（Nt、No），根据下列公式计算细胞的倍增时间(Td）［3］。T代表No~Nt的时间Td=T×Ig2/Ig(Nt/No）
1.3.3细胞周期分析取对数生长期的亲本及实验组细胞各1×106个/ml，制成单细胞悬液，按试剂盒说明进行操作，于流式细胞仪（FCM）上行细胞周期分析。
1.3.4肿瘤标记物CA125、CA199分别将同等数量的亲本及试验组细胞接种于培养瓶内，37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养。待细胞进入对数生长期后，分别收集培养液各10ml，1000r/min离心5min后取上清，用酶联免疫吸附法进行CA125及CA199的检测。
1.3.5激光共聚焦显微镜检测将亲本细胞与试验组细胞制备单层细胞爬片。将载玻片置于培养皿中10%小牛血清1640培养液制成浓度为1×104个/ml的单细胞悬液，待细胞贴壁生长均匀布满载玻片后加入2μg/ml阿霉素作用30min，PBS洗涤细胞2次，在磁共振共聚焦显微镜下观察细胞内的阿霉素浓度以荧光强度表示。然后计算平均值。
2结果
2.1形态学改变倒置显微镜下对数生长期的FRH0201细胞呈铺路石状镶嵌紧密排列，细胞呈多边形、梭形、圆形、不规则形、三角形等各种形态，生长活跃，细胞体积变大，折光性差，核浆比例变大，细胞核增大。有多核细胞，有异常核分裂相。
2.2细胞倍增时间实验组细胞倍增时间为23.6h，延长了约3h。
2.3细胞周期分析实验组细胞与亲本细胞相比：S期细胞增多16.89%，G1期细胞减少29.33%、G2期细胞增多12.46%。见图1、2。
2.5激光共聚焦显微镜检测细胞内的阿霉素浓度以荧光强度表示，计算平均值。见图3。
3讨论
肝门胆管癌及胆囊癌术后化疗是重要的辅助治疗手段，但化疗的敏感性不高。且可能存在个体性差异及可能诱发的肿瘤多药耐药性。为了临床及基础方面对胆道恶性肿瘤综合治疗的研究，FRH0201细胞代表原发灶的所有细胞群体［2］，并已成功建立裸鼠动物模型［3、4］，我们用阿霉素对该细胞株进行干预，观察对其生物学特性的影响。为了更接近临床胆管癌化疗反复间歇用药的特点，对FRH0201细胞采用大剂量反复间歇同一浓度不同时间暴露，历时8个月，获得了稳定生长的细胞。本次试验不同于其它耐药株固定药物浓度，这更符合临床用药方式。在本实验中我们发现在低氧时，肿瘤细胞在含有阿霉素的培养基中可以继续生长繁殖，一旦更换培养基后同样剂量的药物，细胞虽然可以继续贴壁伸展。但药物持续存在时却出现凋亡细胞，随着作用时间的延长，凋亡细胞逐渐减少。该细胞生物学特性的研究将为下一步耐药株的建立，探讨胆管癌耐药机理及逆转耐药奠定基础。以往研究发现，与亲本细胞株比较，耐药细胞株在形态、结构及代谢水平等方面均发生了显著变化［5］。本实验细胞在无药培养1个月后生长稳定，倍增时间稍有延长，其分泌的肿瘤标记物如CA125、CA199较亲本细胞有所降低，这可能与药物抑制细胞活性有关，也可能是药物导致了细胞的分化有关，但是细胞排泄毒性药物的作用得到了增强。我们推测这些生物学性状的改变与其耐药表型密切相关，但其详细机理尚有待进一步研究。经流式细胞仪分析发现，药物处理前后试验组G1期细胞比亲本组约减少29.33%，G2期细胞比亲本组增加12.46%，S期细胞增多16.89%，说明细胞通过细胞周期限制从G1期进入S期，然后阻滞于G2期，G2期的主要特征是RNA的合成和染色质的螺旋化，此期对外界环境敏感，易受各种因素的影响［6］。提示根据药物对胆管癌细胞周期各期的影响，在临床上可以更好地选择不同的化疗药物，联合用药以增加疗效，减少副作用。在经药物作用筛选后1月，细胞内抗肿瘤药物浓度仍明显降低，证明了细胞稳定表达了某种机制，该机制可以使肿瘤细胞耐受阿霉素的杀伤作用，但具体的机制需要进一步证实。本实验提示：（1）通过适当剂量的间歇的持续的冲击应用抗肿瘤药物，可以筛选出持续生长的细胞；（2）胆管癌细胞在阿霉素作用下，细胞内的抗肿瘤药浓度下降，这是肿瘤细胞在含抗肿瘤药物的掊养液中生长繁殖的基础；（3）阿霉素可以影响细胞的分裂增殖周期。但该结论尚需今后进一步实验得以证实。
参考文献
［1］丛文铭，吴孟超，陈汉.肝内胆管癌多基因变异表型分析［J］.中华医学杂志，2001，81：271273.
［2］JokobyWB.Methodsinenzymology［M］.NewYork:AcadPress，1979.150.
［3］吴小鹏，王占民，何晓冉.肝门部胆管癌细胞系FRH0201的建立及生物学特性研究［J］.中华医学杂志，2005，85(25):17841785.
［4］李志伟，王占民，吴小鹏，等.利用裸鼠建立人肝门部胆管癌肝门移植模型［J］.中国现代普通外科进展，2004，7（4）:209.
【关键词】肺癌;干细胞;肿瘤干细胞
【中图分类号】R725【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)02-0227-02
目前，肺癌已成为世界上发病率和死亡率增长最快，严重危害人类健康和生命的恶性肿瘤，5年生存率低于15%。科学家们通过总结大量肿瘤细胞和干细胞的生物学相似性后，提出“肿瘤干细胞”(TSC)理论。该理论的提出为肺癌的治疗带来曙光。
1干细胞
干细胞(SC)是指具有自我更新和分化潜能的细胞。干细胞的自我更新和分化在其内在机制和周围环境中的信号调控下处于动态平衡状态,维持了干细胞的数量稳定。一旦干细胞发生基因突变或信号传导途径发生错误,将导致这一平衡被打乱,引起高度协调的干细胞分裂增殖过程失调,导致肿瘤发生。
2肿瘤干细胞
2001年，科学家们提出了TSC理论，认为肿瘤组织由异质性的细胞群体组成，其中很小部分细胞具有干细胞特性，决定肿瘤的发生、侵袭、转移、播散和对各种治疗是否敏感[1~3]。TSC的最早报道见于白血病。Ai-Hajj等发现乳腺癌干细胞,首次证明了在实体瘤中TSC的存在。目前已成功分离并鉴定的实体TSC包括脑肿瘤、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤及胰腺癌等,肺癌TSC的研究也取得很大进展。
3肺癌干细胞
3.1肺癌干细胞的发现2005年Kim等从大鼠细支气管、肺泡管结合部分离出Sca-1+CD45-Pacam-CD34-细胞,其有很强的自我更新和分化能力,称之为支气管肺泡干细胞(BASCs)，并认为BASCs可能是肺腺癌的起源细胞。2006年,黄盛东等发现,A549细胞悬浮培养可形成3种类型的克隆集落,其中Holoelone型克隆体具有干细胞特性。2007年,Summer等从鼠的肺组织中分离出肺内源的间充质干细胞。Ho等发现肺癌SP细胞较非SP细胞具有更强的致瘤性,表达乳腺癌耐药蛋白(ABCG2)等多种ABC家族膜转运蛋白。Eramo等在人的肺癌组织中发现一群具有自我更新、多向分化能力的CD133+细胞，其具有肿瘤细胞的恶性特征，被命名为肺癌干细胞。
3.2肺癌干细胞的分选方法:肺癌干细胞的分选主要采用三种方法:A.应用细胞表面特异性标记进行分选;B.根据SP表型进行TSC的分选;C.利用干、祖细胞中ALDH的含量较高进行分选。
细胞表面标志物是分选肺癌肿瘤干细胞的关键。Kim等应用流式细胞仪分选出Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+的支气管肺泡干细胞，肺腺癌肿瘤干细胞亦存在与BASCs相似的表面标志物。另一表面标志物是CD133。Eramo等发现CD133+细胞在肺癌标本中普遍存在，但含量较低。科学家们还发现，CD133+肺癌细胞可无血清悬浮培养，含血清培养出现分化；CD133+细胞比CD133-细胞更易形成与原发瘤表型一致的肿瘤，更具耐药性。上述研究显示CD133+细胞可能包含了肺癌干细胞，且和肺癌化疗耐药密切相关。但Meng等[19]对肺癌细胞株中的CD133+及CD133-细胞进行对比，发现二者均可形成移植瘤，故CD133+细胞是否代表肺癌干细胞，仍存在争议。
人们发现造血干细胞具有将荧光染料泵出细胞外的特性,即SP特性[23]。目前利用这一特性进行纯化已成为一种常用的分离方法。SP细胞表面表达ABCG2等ABC家族膜转运蛋白,因此,也可应用ABCG2作为标记分选TSC。
利用干、祖细胞中ALDH的含量较高进行分选肺癌干细胞。在造血系统、神经系统的干、祖细胞、乳腺癌中ALDH含量很高。在乳腺癌中发现ALDH1+肿瘤细胞具有干细胞特性，且与乳腺癌不良预后相关。美国学者应用流式细胞仪从人类肺癌细胞系中分选出ALDH1阳性细胞，发现其具备诸多干细胞特征，并表达CD133，并与肺癌患者的预后呈负相关。
3.3肺癌干细胞的鉴定方法:目前研究认为TSC鉴定必须通过一些经典的干细胞实验进行鉴定。自我更新是干细胞的三大重要特性之一,如CD133+肺癌细胞能够在含生长因子的无血清培养基中以细胞球的方式悬浮生长,这是鉴定其具有自我更新的能力,也是鉴定其是为TSC的重要方法。致瘤能力是鉴定TSC的最重要环节,目前多通过裸鼠致瘤实验进行检验。分化潜能是TSC的重要特征之一，可通过单克隆实验进行检验,以此鉴定其干细胞特性。
4肺癌干细胞的展望
进入21世纪以来，肺癌的治疗已经进入分子时代,对肺癌干细胞的研究越来越受到重视。直接靶定肺癌干细胞，通过寻找特异性的表面分子标志识别肺癌干细胞，制备单克隆抗体，携带放射性物质或化疗药物，靶向放化疗，最终促使肺癌干细胞凋亡，使肿瘤失去生成新的肿瘤细胞的能力，争取达到根治的目的。这些方法将为肺癌的治疗带来了新的曙光。
参考文献
[1]ReyaT.Stemcells,cancer,andcancerstemcells.Nature2001;414(6859):105~111
[2]WichaMS,LiuS,DontuG.Cancerstemcells:anoldideaaparadigmshiftCancerRes2006;66(4):1883~1890
关键词：胰腺癌；SP细胞；CSC；耐药
胰腺癌预后差，5年生存率不足5%，中位生存期仅6个月[1]，胰腺癌细胞恶性生物学行为的机理复杂，容易对化疗药产生耐药性是主要原因之一[2]，因此研究胰腺癌的耐药机制尤为必要。肿瘤干细胞（Cancerstemcells，CSC）学说认为恶性肿瘤中存在极少数具有成体干细胞特征的细胞亚群，是恶性肿瘤耐化疗药物的根源[2]。本研究引入流式细胞术SP细胞分选法分离胰腺癌CSC，初步探索CSC在胰腺癌耐药中的作用。
1资料与方法
1.1一般资料人胰腺癌细胞系PANC-1购自上海中科院细胞库，DMEM培养基购自美国Invitrogen公司、胎牛血清购自美国Hyclone公司、胰蛋白酶购自美国Mediatec公司，Hoechest33342购自美国Sigma公司，Verapamil购自美国Sigma公司，吉西他滨（健择，Gemzar）购自美国Lilly公司，超净台购自AIRTECH公司，二氧化碳细胞培养箱购自NAPACO5410，Zseries细胞计数仪购自美国贝克曼公司，流式细胞仪购自美国Morflow，倒置显微镜购自日本Olympus公司，Western-blot转膜仪购自美国Bio-Rad公司，水浴槽购自江苏常熟医疗器械厂。
1.2方法
1.2.1细胞培养与观察采用体外细胞培养对人胰腺癌细胞系PANC-1进行传代与培养，培养条件严格按照ATCC推荐条件执行；24孔板细胞计数法绘制细胞生长曲线，Zseries细胞计数仪进行细胞计数，获得实验数据。
1.2.2CSC的分离与鉴定采用流式细胞术SP分选法，分离并鉴定PANC-1的SP细胞亚群具有CSC特性。
1.2.3胰腺癌干细胞对吉西他滨的耐受性检测吉西他滨干预SP细胞亚群和non-SP细胞亚群，比较两细胞亚群耐受吉西他滨的差异；进而检测吉西他滨干预PANC-1后SP细胞比例。
2结果
2.1吉西他滨抑制浓度测定见图1。
图1吉西他滨抑制曲线
PANC-1细胞系用0.1～100uM浓度的吉西他滨处理72h，结果显示：0.1μM吉西他滨处理72h，细胞的增殖活力急遽下降，到吉西他滨1μM的时候，细胞增殖活力基本达到了最大抑制。结合文献报道，本课题选用1μM浓度和10μM浓度作为吉西他滨干预PANC-1的SP细胞亚群和non-SP细胞亚群的实验浓度，以探讨两亚群对吉西他滨的敏感性。
2.2人胰腺癌细胞SP细胞对吉西他滨作用不敏感见表1，1μM吉西他滨作用PANC-1的SP细胞72h后，平均活细胞数是39346.7，未分选的PANC-1活细胞数是6463.3，而non-SP活细胞数是496.0（P
2.3吉西他滨诱导PANC-1后SP细胞比例增加见图2。
图2A
图2B
图2吉西他滨干预PANC-1后SP细胞比例升高
吉西他滨干预PANC-1细胞后，检测到对Velapamil敏感的SP细胞，其比例升高（图2B），由8.74%±0.33%升高至22.67%±3.21%（图3A），具有统计学差异（P
3讨论
流式细胞术SP（Sidepopulation）分选法利用干细胞对Hoechest33342拒染的原理，分离出具有干细胞特性的SP细胞，SP细胞在许多肿瘤领域被证实具有肿瘤干细胞特性[3]。获得高纯度的肿瘤干细胞是CSC研究的基础，胰腺癌缺乏公认CSC表面标志物，SP分选法为胰腺癌CSC分离鉴定提供了新的思路。本课题组研究[4]发现人胰腺癌细胞系PANC-1存在Verapamil敏感的SP细胞，含量8.74%±0.33%；加入维拉帕米后SP细胞降低90%左右，数量明显减少，证实人胰腺癌细胞系中确实存在SP细胞亚群存在。本课题组通过平板克隆实验、细胞分化实验、裸鼠成瘤实验、流式细胞仪分析细胞周期、Transwell法检测侵袭和迁移能力检测胰腺癌细胞SP细胞亚群和non-SP细胞亚群生物学功能差别，显示SP细胞亚群具有更强的自我更新和增殖分化能力，证实SP细胞符合肿瘤干细胞学说的特点[4]。
胰腺癌SP细胞是否对化疗药物有较强的耐受性，需要进一步研究。吉西他滨的出现标志着胰腺癌的药物治疗取得显著的进步，被证实为第一个能有效缓解胰腺癌症状和改善预后的抗癌药物，是中晚期胰腺癌和胰腺癌术后的标准治疗[5]。本课题用0.1～100μM浓度的吉西他滨处理PANC-1细胞72h，活细胞计数法检测不同浓度吉西他滨对胰腺癌细胞增殖的抑制作用，结果表明0.1μM吉西他滨能够对PANC-1细胞的增殖活性有明显抑制作用，吉西他滨是治疗胰腺癌的有效药物[5]。
许多接受吉西他滨治疗的胰腺癌患者在承受了化疗毒副作用的同时，没有得到较好的治疗效果，本课题结果也显示吉西他滨处理胰腺癌细胞系后，仍然有残存细胞，提示胰腺癌的内在的或（和）获得性的耐药性是影响胰腺癌化疗效果的主要原因[5]。肿瘤干细胞学说为恶性肿瘤多药耐药特性的研究提供了重要理论基础，实验提示该亚群对化疗药物耐受，治疗后该亚群细胞的丰度还有可能提高，导致残留恶性肿瘤细胞恶性生物学行为的增加，这一现象在一些实体肿瘤中得到了证实[5]。
在胰腺癌领域，Hermann等[6]发现长期吉西他滨治疗使CD133+胰腺癌干细胞的比例增加，CD133+细胞具有明显的耐药性，延长干预时间到5d后，胰腺癌细胞中CSC的比例反而增加至50%；加大药物剂量后也不能完全杀死CD133+细胞。随后研究[7，8]也发现应用放疗和吉西他滨干预人胰腺癌组织异种移植瘤模型后，反而使CD44+CD24+ESA+的胰腺癌CSC比例增加；应用治疗剂量吉西他滨干预胰腺癌细胞后，细胞出现选择性生长，耐药细胞中CSC细胞表面标志物表达呈上升趋势。这些研究以胰腺癌表面标志物分离CSC，胰腺癌CSC目前还没有公认的特异性表面标志物，也使胰腺癌CSC耐药机制受到质疑。
为深入探讨胰腺癌CSC和耐药机制，本课题通过流式细胞仪分析细胞周期显示SP细胞较non-SP胞处于静止状态，符合干细胞特殊生物学特性--CSC通常处于静态[4]，多数抗肿瘤药物都通过抑制DNA合成或肿瘤细胞分裂，抑制肿瘤细胞生长，肿瘤细胞须有积极分裂才能对抗肿瘤药物敏感，化疗只是引起非CSC被杀死，静态的CSC在化疗后大多数生存下来[9]，导致恶性肿瘤复发转移。
本研究结果显示PANC-1的SP细胞和non-SP细胞亚群的细胞增殖能力对吉西他滨的敏感性有明显差异，SP细胞较non-SP细胞对吉西他滨耐受性强，有效剂量的吉西他滨干预后SP细胞能够继续增殖，且增殖能力远高于non-SP细胞；提示SP细胞能够耐受吉西他滨的抑制细胞复制的药理作用。
进一步结果显示吉西他滨干预后胰腺癌细胞系SP细胞含量提高，进一步证实SP细胞对吉西他滨耐受性较强；对吉西他滨不敏感的SP细胞存活下来，提示PANC-1的SP细胞亚群对吉西他滨不仅不敏感，吉西他滨干预可以提高SP细胞的丰度，导致残留胰腺癌细胞恶性生物学行为的增加。
细胞静止状态及耐受化疗药物是CSC的基本生物学特征[4]，人胰腺癌PANC-1的SP细胞亚群具有胰腺癌CSC特性，流式细胞术SP分选法能够分离CSC和非CSC亚群，有效剂量的吉西他滨干预后CSC能够继续增殖，且增殖能力远高于非CSC，提示胰腺癌CSC较非CSC对吉西他滨耐受性强，CSC能够耐受吉西他滨的抑制细胞复制的药理作用，胰腺癌干细胞是胰腺癌细胞耐药的根源：要治愈胰腺癌必须杀灭胰腺癌CSC，而要杀灭胰腺癌CSC就必须继续阐明其恶性分子生物学机制，找到其靶向性的治疗位点[10]。
参考文献：
[1]ChenW，ZhengR，ZhangS，etal.ReportofincidenceandmortalityinChinacancerregistries，2009[J].ChinJCancerRes，2013，；25（1）：10-21.
[2]XinHW，AmbeCM，HariDM，etal.Label-retaininglivercancercellsarerelativelyresistanttosorafenib[J].Gut，2013，14.
[3]RichardV，NairMG，SanthoshKumarTR，PillaiMR.Sidepopulationcellsasprototypeofchemoresistant，tumor-initiatingcells[J].BiomedResInt，2013：517237.
[4]WangX1，LiuQ，HouB，etal.Concomitanttargetingofmultiplekeytranscriptionfactorseffectivelydisruptscancerstemcellsenrichedinsidepopulationofhumanpancreaticcancercells[J].PLoSOne，2013，8（9）：e73942.
[5]AwasthiN，ZhangC，HinzS，etal.Enhancingsorafenib-mediatedsensitizationtogemcitabineinExperimentalPancreaticCancerthroughEMAPII[J].JExpClinCancerRes，2013，32（1）：12.
[6]HermannPC，HuberSL，HerrlerT，etal.Distinctpopulationsofcancerstemcellsdeterminetumorgrowthandmetastaticactivityinhumanpancreaticcancer[J].CellStemCell，2007，1（3）：313-323.
[7]HoriY.Prominin-1（CD133）RevealsNewFacesofPancreaticProgenitorCellsandCancerStemCells：CurrentKnowledgeandTherapeuticPerspectives[J].AdvExpMedBiol，2013，777：185-196.
[8]ShahAN，SummyJM，ZhangJ，etal.Developmentandcharacterizationofgemcitabine-resistantpancreatictumorcells[J].AnnSurgOnco，2007，14（12）：3629-3637.