生物细胞的定义范文篇1

关键词:生物建模;计算机模拟;诱导分化剂;氨基甾体;白血病细胞

中图分类号:TP391文献标识码:A

1引言

患者一经被确诊为白血病后,最常用的治疗方法就是抗白血病药物治疗｡尽管骨髓移植为根治白血病带来了希望,但该方法受到供体和配型等多方面的限制,而药物治疗乃是目前较经济实用的方法之一｡药物治疗方法主要是通过抑制白血病细胞的增殖,诱导白血病细胞的分化来实现｡由于药物治疗可产生耐药性和白血病的复发,人们希望了解药物治疗失败的原因,从而提高白血病的治愈率｡我们研究了一种新型诱导分化剂氨基甾体,发现该类药物对白血病细胞,尤其是对慢粒K562白血病细胞具有效好的治疗效果[1]｡因此,我们在改进的基础上建立了一种计算机模型[2],去除了不合理的部分,使其与实验情况更加吻合,并用以分析白血病细胞在药物作用下的生存率,从而模拟药物对白血病细胞的治疗效果,并将氨基甾体类药物的实测治疗效果与该计算机模型进行比较,以检验该模型的预测性和准确性,为药物治疗白血病疗效的提高提供新的思路｡

2模型的建立

2.1基本思路

人体内的各类血细胞是由骨髓的造血细胞增殖分化衍变而来,而这种增殖分化是受人体基因严密调控的｡在正常状态下,人体的各类血细胞在数量和形态上是维持恒定不变的｡目前已知人体内有两类基因:致癌基因和抑癌基因｡当环境和自身因素的改变,导致致癌基因高度表达时,人体就可能产生白血病,即造血细胞产生恶变,大量增殖,又不具备正常血细胞的功能,这被称为癌变(malignanttransformation)｡

怎样确定造血细胞是否癌变,细胞表型的改变是一个较佳指标｡细胞表型涉及到细胞的增殖,分化,凋亡等等变化,而这些表型的变化又与细胞的表观熵值改变密切相关[3]｡所以我们试图用细胞的表观熵值来描述细胞表型的改变,从而确定细胞的增殖与分化状态｡反言之,用药物作用于白血病细胞后,细胞的表型会改变,细胞的表观熵值亦会改变,从而可确定该药物的治疗效果(图1)｡

计算技术与自动化2007年6月第26卷第2期王光源等:一种基于计算机的白血病细胞治疗效果数学模型

我们将细胞表观熵定义为细胞癌变､增殖､分化､凋亡､抑制等方面的细胞行为的综合表现｡故可得定量方程式式中P为细胞总的表观熵,P1为癌变的表观熵,P2为分化的表观熵,P3为凋亡的表观熵,P4为增殖的表观熵｡P值为实测值与预测值的比值｡

如果进一步将癌变(Transformation)和分化(Differentiation)两种状态定义为T和D,那么根据生物系统中熵的经典定义[4]:在任何一种生物系统中,当存在W种相关状态时,该系统的熵值便为:

熵值E=cln(∑W)(2)

式中c为比例常数｡那么,就可得出:

在(3)式中,我们假设当癌变白血病细胞向下增殖分化时(即由1个细胞变为2个细胞时),其中有1个细胞仍保留癌变细胞的特性｡

在细胞群中,我们定义细胞总数为N,而将实际计数的细胞数定义为n,则有:凋亡的细胞数(或被抑制的细胞数)=N-n,那么,将(4)式经过数学中的Stirling概约[5],又设R=n/N,则(4)式整理为:

其中R值的定义域为:0

将公式(1),(3)和(5)合并得:

从(6)式可得出,白血病细胞的细胞表观熵与癌变状态(可用癌基因表达百分率T表示)有关,与细胞分化状态(可用分化百分率D表示)有关,亦与白血病细胞的细胞数(可用计数百分率R表示)有关｡如果在相同实验条件下,生物体系的比例常数c是恒定的,则细胞的表观熵值:

式(7)就是该模型的主要公式,可根据该公式模拟药物对白血病细胞的抑制增殖,诱导分化和癌基因表达效果(模拟结果见表1)｡

2.2模型的推广

如果我们将药物对白血病细胞的百分抑制率引入到式(7),并设百分抑制率为I｡又因为R=1-I,则式(7)变为:

根据公式(8),当药物对白血病细胞的百分抑制升高时,细胞表观熵值应该是增加的｡那么根据热力学第二定律:

E瘟魄蔼

即药物治疗后细胞表观熵值增加｡或:

即得:H

采用Mathcad软件编程,在假设D1,D2,T1,T2和I1已知的情况下,就可预测可能的I2值,即药物治疗后,白血病细胞可能的生长状态(或抑制率)｡

3计算机模拟结果与讨论

3.1计算机编程流程方框图

计算机编程采用Mathcad软件完成,方框图如下(图2):

3.2新型诱导分化剂对细胞表观熵变的影响

表1计算了在不同D､T和I值情况下,细胞的表观熵值｡从表1可知,当药物治疗处理开始时(治疗效果级别1),抑制率I仅为20%,癌基因的表达率T较高,为90%,此时的分化率D较低,为20%,该系统的细胞表观熵值为负值(-0.35)｡随着药物作用的加强,抑制率I从20%上升到90%,此时癌基因的表达率T则从90%降到20%,分化率D则从20%上升到90%,这是一种理想的治疗效果(治疗效果级别5)｡

纵观E值,此时细胞的表观熵值由-0.35增加至3.30,说明随着治疗效果的提高,白血病细胞表观熵值增加｡根据热力学第二定律,系统熵值的增加,意味着系统内分子混乱性或无序性的增加｡那么在白血病细胞内,药物可能引起了化学分子的转运,变化,断裂和重构,从而导致白血病细胞的分化和凋亡｡表1说明该模型与药物治疗效果吻合｡

我们研究的新型诱导分化剂氨基甾体[6],基本上与以上的模型接近｡我们证实该类诱导分化剂可干扰K562白血病细胞的增殖,在10-6mol/L浓度时,第4天的抑制率I值约为50%,T值约为48%(bcr/abl癌基因表达),而D值约为90%(向红系分化的CD71表达)｡根据这些参数,计算出的细胞表观熵值为:

E=ln[0.9(0.48+1)/(1-0.5)(0.5)0.5/(1-0.5)]=1.67

将该值与表1中的熵值比较,该治疗效果约相当于表1中的第3级治疗效果(E=1.62)｡可见新型诱导分化剂氨基甾体在次高浓度,在较短的时间对白血病细胞的治疗效果亦较佳｡如果将其浓度提高到10-5mol/L,将作用时间延长到第5天,实验已证实其治疗效果接近该模型的理想治疗效果(即第5级效果)｡

3.3药物治疗前后细胞表现熵值的变化

根据公式(9),当固定药物治疗前的细胞抑制率I1值不变,假设药物治疗前后,D1变为D2(D1D2),T1变为T2(T1T2),那么可模拟估算出药物作用后的细胞抑制率,如表2所示:

表2模拟的结果表明,在5种治疗情况中,当输入的药物治疗后抑制率I2从0%到99%变化时,系统均符合熵值增加的热力学第二定律(H

4结论

生物细胞的定义范文1篇2

方法：WST1法观察威灵仙皂苷对MR2细胞的增殖抑制作用；用流式细胞仪观察MR2细胞的凋亡率。

结果：威灵仙皂苷可明显抑制MR2细胞的增殖，诱导MR2细胞凋亡，且呈时间浓度依赖性。

结论：威灵仙皂苷能够明显抑制早幼粒细胞白血病耐药细胞株MR2增殖和诱导MR2细胞凋亡，呈时间浓度依赖性；高浓度威灵仙皂苷对MR2细胞的效果与亚砷酸无统计学差异。

关键词：威灵仙皂苷MR2细胞细胞凋亡

【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2013）06-0009-02

随着全反式维甲酸和砷剂的广泛使用，急性早幼粒细胞白血病（APL）的预后已经得到明显改善。但是对全反式维甲酸耐药以及砷剂长期使用后的毒副作用仍然不利于患者的长期生存，因此仍然需要安全、有效、经济的方法，治疗全反式维甲酸耐药APL患者。威灵仙是一味价廉物美的中药，主要用于治疗风湿性骨痛，腰背痛。研究发现其发挥作用的主要成分是皂苷，且已有报道其有明显的抗恶性肿瘤的效果[1]。本研究选择APL耐药细胞株MR2为研究对象，初步探讨威灵仙皂苷对APL耐药细胞的凋亡作用。

1材料与方法

1.1细胞株：耐全反式维甲酸急性早幼粒细胞白血病细胞株（MR2细胞）引自四川大学华西医学院。

1.2实验试剂：威灵仙皂苷（在泸州医学院药研所）自行提取[1]；二甲基亚砜DMSO购于Sigma公司；WST1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购于江苏碧云天生物技术研究所；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司；亚砷酸购于黑龙江哈尔滨医大药业有限公司（10mg/支）。

1.3细胞培养：将MR2细胞接种于RPMI1640培养液中，置于50ml/LCO2、饱和湿度、37℃恒温孵箱中悬浮培养，每2-3d换液传代。

1.4WST-1法检测威灵仙皂苷对MR2细胞的增殖抑制作用：选择对数期生长期MR2细胞，将细胞调整为浓度为1×104个/ml并接种于96孔酶标板，每孔加细胞悬液100ul，共设8个实验组（每组5个平行孔，实验重复三次），以终浓度0.01%DMSO为空白对照组，终浓度1.0umol/l亚砷酸为阳性对照组，终浓度200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威灵仙皂苷为实验组。分别培养24h、48h、72h后。每孔加入10ulWST-1溶液，继续在细胞培养箱孵育2h后。在450nm测定，按以下公式计算抑制率。

细胞增殖抑制率（%）=（1-A实验组A对照组）×100%

1.5流式细胞仪检测凋亡率：调整细胞浓度为1×106个/ml接种于六孔板，设五个实验组（每组设三个平行对照，实验重复三次），以终浓度0.01%DMSO为空白对照组，终浓度1umol/ml亚砷酸为阳性对照组，终浓度800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml威灵仙皂苷为实验组。分别培养72h。用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6统计学分析：实验数据计算均值、标准差，各组应用方差分析，以a=0.05为检验水准，P

2结果

2.1威灵仙皂苷对MR2细胞有明显的生长抑制作用：不同浓度的威灵仙皂苷对MR2细胞均有明显的生长抑制作用，且呈时间和浓度依赖性。统计学分析表明，亚砷酸阳性对照组与皂苷实验组总的差异有统计学意义（见表1）。

2.2流式细胞仪。AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡：分别用亚砷酸组与皂苷800ug/ml、1000ug/ml、1200ug/ml组作用MR2细胞72小时后应用流式细胞仪检测凋亡率为（见表2）：统计学分析：亚砷酸组与皂苷1200ug/ml组之间差异无统计学意义；亚砷酸组和皂苷1200ug/ml组与皂苷800ug/ml、1000ug/ml组间差异有统计学意义；皂苷800ug/ml组与皂苷1000ug/ml组间差异有统计学意义。

3讨论

威灵仙是一味价廉物美的中药，近年来大量研究证明，其主要成分皂苷具有良好的抗肿瘤作用[1]。如人参皂苷抗肿瘤机制主要通过调控肿瘤细胞增殖周期、诱导细胞分化和凋亡来发挥抗肿瘤作用[2]；九节龙皂苷通过抑制肿瘤细胞生长来抗小鼠肝癌和黑色素瘤[3]。提示皂苷有很好的研究和开发前景。但其抗白血病的作用和机制还未见报道。MR2细胞株来源于APL细胞株NB4细胞对ATRA耐药的细胞克隆，可表达PML-RARa融合蛋白，其重组蛋白配体结合功能区活性下降或丧失[4]。该细胞株可用于筛选新分化诱导剂和APL耐药机制的研究。在实验中我们通过WST-1证明威灵仙皂苷可明显抑制MR2细胞的生长增殖，用流式细胞仪定量、定性的证明威灵仙皂苷能够诱导MR2细胞凋亡。且WST-1和流式细胞仪的数据表明高浓度的威灵仙皂苷的增殖抑制率和凋亡率与亚砷酸组的差异无统计学意义，这意味着高浓度的威灵仙皂苷对MR2细胞的增殖抑制作用、凋亡作用与亚砷酸是一致的。总之，我们的研究显示威灵仙皂苷对MR2细胞有明显的诱导凋亡作用，但具体的作用机制有待进一步研究明确。

本实验证实，威灵仙皂苷具有抑制急性早幼粒细胞白血病MR2细胞株增殖及诱导其凋亡的作用，为临床威灵仙皂苷用于抗肿瘤治疗提供一定的理论依据。

参考文献

[1]徐先祥，夏伦祝.大孔吸附树脂分离纯化威灵仙总皂苷的工艺研究.中药新药与临床药理，2006，17（1）：57-59

生物细胞的定义范文篇3

【摘要】目的研究shRNA干扰midkine对胃肿瘤细胞BGC823增殖能力及凋亡的影响。方法构建midkine基因的特异性小RNA干扰质粒，采用脂质体2000转染BGC823细胞，运用CCK-8检测细胞的增殖能力，PI染色检测细胞凋亡情况。结果成功转染重组体的BGC823细胞增殖明显受到抑制(P

【关键词】midkine;shRNA;胃肿瘤细胞;细胞增殖;细胞凋亡

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofknockdownofmidkine(MK)expressionbyshRNAoncellproliferationandapoptosisofhumangastriccarcinomacellBGC823.MethodsSpecificshRNAplasmidstomidkinewereconstructed，andwerethentransfectedintoBGC823bylipofectamin2000.ThecellproliferationwasevaluatedbyCCK-8kit，andtheapoptosiswasdeterminedbyflowcytometricanalysis.ResultsTherecombinantplasmidexpressingmidkineshRNAeffectivelyinhibitedBGC823cellproliferation(P

Keywords:midkine;shRNA;gastriccancercell;cellproliferation;apoptosis

Midkine(MK)是一种肝素结合生长因子，MK在多种正常组织中也有表达，在小肠黏膜组织高表达，在肺、结肠、胃、肾和脾低表达，在肝脏中没有表达，MK在多种肿瘤组织中的表达比相应的癌旁和正常组织高[1]。在我们前期研究工作[2]中发现MK在中国胃肿瘤患者的肿瘤组织中高表达，并与临床分级相关。在多种肿瘤细胞系中，MK具有促纤溶、促血管形成和抗凋亡作用，能诱导NIH/3T3细胞、SW-13细胞和UNUC3细胞转化[1，3]。胃癌患者的尿液和血清中的MK水平都有所增加[4-5]，肿瘤切除后血清MK水平就会下降[6]。这些资料表明MK与胃肿瘤的发生发展相关，可作为诊断指标和治疗靶标。本研究旨在以MK为靶标进行干扰，观察MK干扰后胃肿瘤细胞增殖及凋亡情况。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1肿瘤细胞BGC823细胞株购自中国科学院细胞所。

1.1.2pSilencer2.1U6和pSilencer3.1H1载体pSilencer2.1U6和pSilencer3.1H1载体购自Ambion公司，pSilencer2.1U6的载体含有U6RNA聚合酶Ⅲ启动子;pSilencer3.1H1载体含有H1RNA聚合酶Ⅲ启动子。两者都同时含有氨苄青霉素和G418抗性基因，前者可用于在原核细胞的筛选，后者则可用于在真核细胞的筛选。2个载体在购买时呈开环的线状，两端分别留有BamHI和HindⅢ的酶切位点。

1.1.3主要试剂PI为南京凯基生物公司产品;Llipofectamin2000转染试剂和Opti-MEM购自Invitrogen公司;各种限制性内切酶、总RNA提取试剂盒、质粒抽提试剂盒、反转录试剂盒、核酸电泳试剂均为TaKaRa公司产品;PCR扩增试剂为天为时代公司产品。

1.2方法

1.2.1发夹状双链MK-siRNA基因序列的合成根据前面研究中MK-siRNA序列[7]设计发夹双链RNA基因序列，正义链：5′GATCCGTGAAGAAGGCGCGCTACAATGCTCATTCAAGAGATGAGCATTGT

AGCGCGCCTTCTTCATTTTTTGGAAA′;反义链：5′AGCTTTTCCAAAAAATGAAGAAGGCGCGCTACAAT

GCTCATCTCTTGAATGAGCATTGTAGCGCGCCTTCT

TCACG3′。序列由Ivitrogen公司合成。合成的MK发夹状双链RNA基因序列的两端分别引入BamHI和HindⅢ两个酶切位点。然后，按照下列方法把合成的2条单链DNA配对形成双链：以50μl去离子分别溶解合成的2条单链DNA;分别取5μl溶解的单链DNA，然后加入40μl1×DNA退火溶液(100mmol/L醋酸钾、30mmol/LpH7.4Hepes、2mmol/L醋酸镁)混合;90℃3min，冷却至37℃并保温1h，逐步冷却至室温，这样2条单链DNA就配对形成了双链，并且其两端设计合成的BamHI和HindⅢ黏性末端也暴露出来了。-20℃保存备用。

1.2.2pSilencer2.1-U6-mksiRNA和pSilencer3.1-H1-mksiRNA质粒的构建购买的pSilencer2.1-U6和pSilencer3.1-H1是已经含有BamHI和HindⅢ酶切位点的线形载体，故可以用以下方法连接上述已经配对形成双链的MK发夹状RNA的基因：1μlMK发夹状RNA的基因，6μlddH2O，1μl10×T4DNA连接缓冲液，1μlpSilencer2.1-U6或pSilencer3.1-H1载体，1μlT4DNA连接酶(5U/μl)，把上述液体混合均匀，16℃过夜，转化感受态E.coliDH5α，随机挑取菌落于含100mg/L氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，进行测序，序列正确的即为pSilencer2.1-U6-mksiRNA和pSilencer3.1-H1-mksiRNA质粒。对照质粒插入的片段为针对GFP的序列，称为pSilencer2.1-U6和pSilencer3.1-H1。

1.2.3构建质粒的转染和阳性克隆的筛选肿瘤细胞在24孔板上用PRMI-1640培养基，含10%的小牛血清和青霉素、链霉素在37℃5%CO2细胞培养箱中培养至90%～95%的细胞覆盖率。然后，吸去培养液，用不含青霉素、链霉素和小牛血清的PRMI-1640培养基洗1次。细胞转染按Lipofectamin2000质粒转染操作说明进行操作，质粒用量为0.8μg，转染后37℃5%CO2下培养72h。

1.2.4总RNA提取、Reversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)RNA提取按照TRIzol试剂盒操作指南进行，并通过琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的完整性。反转录依照试剂盒操作说明进行，总反应体系为25μl，反转录条件为42℃反应60min，PCR引物：MK(385bp，28个循环)，上游的引物：5′AAAAAAGCTTATGAAAAAGAAAGATAAGGTGAAGAAG3′。下游引物：5′AAAAGAATTCCTAGTCCTTTCCCTTCCCT3;β-actin(280bp，28个循环)，上游引物：5′CCACGAAACTACCTTCAACTCC3′;下游引物：5′TCATACTCCTGCTGCTTGCTGATCC3′。cDNA产物直接取2μl加入PCR反应体系进行PCR扩增。PCR反应程序为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环后，72℃维持5min，反应结束后，取5μl反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增产物。

1.2.5细胞增殖活力检测细胞增殖活力检测参照CCK8-kit说明书进行操作，详细方法如下：将转染pSilencer2.1-U6-mksiRNA和pSilencer3.1-H1-mksiRNA、空载体和未转染的细胞悬液按100μl/孔加入96孔培养板中，每组孔做6个复孔。37℃5%CO2饱和湿度下培养。在1、2、3、4、5天，每孔中加入10μlWST-8〔2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium，monosodiumsalt〕，置37℃5%CO2饱和湿度继续培养4h，于酶标仪(HynergyTMHT，BIO-TEK，USA)450nm处比色，获得光密度(D)值。

1.2.6平板克隆形成实验将不同处理并对数生长期细胞接种到6孔板，每种细胞接种3孔，1000个/孔，以十字方向轻轻晃动6孔板，使细胞分散均匀。在37℃、5%CO2的培养箱中，静止培养7～10天至6孔板出现肉眼可见的克隆[7]。PBS小心洗涤细胞2次，甲醇固定30s，0.1%结晶紫液染色15min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥。凝胶成像系统拍照计数克隆数。

1.2.7PI检测亚二倍体峰不同处理的细胞，胰酶消化PBS洗，2000rpm(约375g)，离心5min，获得细胞(107/ml);取100μl细胞悬液，加入1ml70%乙醇(用过滤除菌的双蒸水配制)固定2h;用PBS洗细胞2次，4℃，2500r/min，5min×2次;100μlPBS(2%TritonX-100，2%RNaseA)重悬细胞;加入100μlPI染液，4℃避光显色30min;4℃，加300μlPBS;流式细胞仪(flowcytometer，FCM)检测[8]。

1.3统计学处理实验数据用±s表示，利用one-wayANOVA进行组间统计学分析，P

2结果

2.1MK干扰后mRNA表达水平的检测将构建的pSilencer2.1-U6-mksiRNA和pSilencer3.1-H1-mksiRNA质粒利用Lipofectamin2000转染到BGC823细胞，通过RT-PCR检测双链发夹RNA对MK的抑制作用。pSilencer2.1-U6-mksiRNA和pSilencer3.1-H1-mksiRNA转染72h，在BGC823细胞中MK的mRNA表达水平都明显降低，而β-actin的表达没有受到影响。空载体对MK和β-actin的表达均没有影响(图1)。2种质粒的干扰效果相比没有明显差别。

图1MK干扰后通过RT-PCRMKmRNA表达水平检测

M：DL2000;1：pSilencer3.1-H1-mksiRNA处理组;2：pSilencer2.1-U6-mksiRNA处理组;3：pSilencer3.1-H1处理组;4：pSilencer2.1-U6处理组;5:未转染细胞

2.2双链发夹MKRNA对细胞生长的抑制作用为检测低表达的MK对BGC823细胞生长状况的影响，细胞存活能力用CCK8-kit检测。在第1、2、3、4、5天，与未转染细胞和转染空载体的细胞相比，转染了siRNApSilencer2.1-U6-mksiRNA和pSilencer3.1-H1-mksiRNA质粒的BGC823细胞增殖能力明显受到抑制(图2)。从集落形成实验结果(图3)可以看出转染了psiRNApSilencer2.1-U6-mksiRNA和pSilencer3.1-H1-mksiRNA质粒的BGC823细胞的克隆数与对照组相比降低了约4倍。这些结果说明MK-shRNA能显著的抑制BGC823细胞的生长。转染了siRNApSilencer2.1-U6-mksiRNA和pSilencer3.1-H1-mksiRNA质粒的BGC823细胞增殖能力受抑制程度没有明显差别。后面的实验选用pSilencer3.1-H1-mksiRNA质粒转染细胞。

2.3双链发夹MKRNA促细胞凋亡的作用处于增殖周期中的细胞，根据其所处的周期不同(G0/G1、S、G2/M)，其DNA含量分布在2～4倍体之间。发生凋亡的细胞由于细胞内的DNA断裂成许多小片段，在用乙醇固定后，用细胞膜通透剂(DNA抽提液)使小分子量的DNA片段穿过细胞膜，使细胞内原有的DNA部分的丢失，仅剩下大片段的DNA，这些细胞在DNA染色后，用流式细胞检测术检测其DNA含量，会出现1个DNA含量

转染pSilencer3.1-H1-mksiRNA质粒以后，BGC823细胞的凋亡百分比为31.76%，而对照组没有转染的细胞凋亡百分比小于2%，转染空载体pSilencer3.1-H1的细胞凋亡百分比小于4.5%(图4A)。对流式细胞仪分析结果进行统计分析，结果如图4B(3次实验的平均值)所示，与未转染细胞和转空载体的细胞相比，转染了pSilencer3.1-H1-mksiRNA质粒的BGC823细胞凋亡数明显增多，具有统计学意义，转染空载体细胞与未转染细胞相比细胞凋亡数的差别无统计学意义。

3讨论

近年来以MK为靶标进行疾病治疗得到了关注，小鼠MK反义寡核苷酸能抑制直肠癌细胞CMT-93的生长[9];Morpholinoantisenseoligomer能抑制PC-3细胞和SW620细胞体外生长和体内成瘤[10]。但是，反义寡核苷酸技术抑制特定基因的表达存在着其自身不可克服的缺点：①作为分子探针的反义寡核苷酸只能外源合成，再注射到体内发挥作用;②反义寡核苷酸在合成时为避免被体内各器官组织中的核酸酶分解，都必须进行修饰。因此，利用反义寡核苷酸药物进行治疗成本高、疗程长，在治疗过程中必须连续多次给药才能保证体内的反义寡核苷酸浓度。而且长时间注射外源反义寡核甘酸有可能在体内引发干扰素的产生，导致非特异阻断基因的表达。与反义寡核苷酸技术相比，RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)更灵敏，可避免干扰素效应，能高效、特异地引起基因转录后沉默，使其丧失表达蛋白或多肽的能力，并且可以通过多种方法给药。目前，RNAi技术已广泛应用于基因功能、信号传导通路的研究以及基因治疗新策略的研究。

我们前期研究发现针对MK特异的siRNA能有效抑制细胞增殖、并促进细胞凋亡[11]。在本研究中我们使用的shRNA是由RNA聚合酶Ⅲ启动子(U6和H1)从DNA模板上转录产生的，其对哺乳动物细胞能产生RNA干扰作用。RNA聚合酶Ⅲ的优势在于能直接从5′-3′转录产生小的非编码RNA，并在遇到4～5个连续的T后就中止转录。RNA聚合酶Ⅲ启动子的这种特性使得它在体内从DNA模板上转录出的siRNA与在体外合成的siRNA的活性非常一致[12]。本实验结果表明转染pSilencer2.1-U6-mksiRNA或pSilencer3.1-H1-mksiRNA质粒可以明显抑制胃肿瘤细胞BGC823生长(图2)，并且促进细胞凋亡(图4)，效果与直接使用siRNA一致[11]，另外与直接使用siRNA相比可以大大节省成本，并且可以实现稳定转染，但两种启动子的转录效果没有差别。

总之，本研究证明，RNA聚合酶Ⅲ启动子启动转录产生的针对MK的shRNA可以抑制胃肿瘤细胞BGC823生长并促进细胞凋亡，这为MK基因靶向治疗提供一定的实验依据。

参考文献

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生物细胞的定义范文1篇4

关键词：思维导图；高中生物；教学分析；实践运用

中图分类号：G633.91文献标识码：B文章编号：1672-1578（2017）05-0178-01

前言：高中生物教学涉及很多生物信息数据和课堂实验操作，不仅强调了课本上的理论知识，更加注重培养学生在实验室的动手能力。必须把实践课程与理论课程更好的相结合，才能让高中生进行良好的素质教育。老师以树枝的延展效果图的形式展把知识点串联起来，不仅加了深学生对内容的印象、提高学生的学习效率，并且把知识有规律的进行梳理整合，不仅培养了学生的自主学习能力、并且激发了学生的探索研究的学习兴趣，让学生能够发自内心的爱上生物、爱上学习、爱上学校。

1.思维导图的特点和优势

1.1思维导图这种学习方式，可以通过以图文并茂的延展效果图的形式把知识点串联在一起，并且更加具体、有想象力、有层次、有规律地展现出来。让学生能够更加轻松、更加灵活、更加容易地接受、记忆和消化知识点。

1.2充分发掘人类大脑的潜能。通过不断的联想和拓展知识点自发性的去丰富课程内容，能够有效提高人类大脑的记忆力和接受教育的学习能力。能够充分培养学生的延展性思维和创造性思维。

1.3减少了教师教学课程难度。教师可以将思维导图法与高中生物学进行有效地整合，清晰的梳理出系统性的生物教学知识点，有利于学生通过知识的分布网从而找到知识点和知识点之间的联系。让教师能够更加轻松、更加灵活、更加高效率的完成教学任务。

2.思维导图在教学中的应用建议

2.1必须遵循以教材为基础的理念完成思维导图教学：思维导图法只是一种教学当中的一种辅助教学的手段，课堂教学内容的设置最终要以学校教材为基础，合理地、巧妙地、灵活地运用思维导图法教学，培养学生的延展性思维模式和提高学生的自主学习能力，更好地促进学生对高中生物学习内容的掌握。

2.2必须结合学生实际特点和需要完成思维导图教学：在现代教育理念下，学生是课堂学习的主体，教师是作为学生学习的辅助者和引导者而存在。老师必须充分利用高中学生们在现有的这个年龄段所具有的特征和特点，并且结合实际的课程任务，来完成思维导图教学。

2.3恰当选择教学内容促进学生创新性思维发展：在实际教学过程中当中，有些教学内容具有一定的开放性、有些内容是固定的、不可转变的。比如说：生物公式的固定的，成分分子是固定的，化学配料比例是固定的。这就要求教师在教学过程中要学会分辨知识的性质和类型，灵活的运用思维导图法。

3.思维导图法教学的实际案例分析：

本篇文章结合作者自身对思维导图法的理解、结合高中生物课程中当中的"细胞的生命历程"这一知识点进行一次系统性的联想和梳理。

3.1细胞的生命历程分为5个阶段：（1）细胞的增殖。（2）转变成为细胞的分化。（3）细胞的分化转变为细胞的衰老。（4）细胞的衰老导致细胞的凋亡。（5）细胞分化也会导致细胞的癌变。

由以上5个大的知识点又细化成一些列小的知识分支。

3.2细胞的增殖。（1）细胞周期。需要记住的知识点：概念、分期、分裂期。（2）分裂方式。需要记住的知识点：有效分裂（概念、过程、意义）、减数分裂、无效分裂（过程、特点、实例）。（3）细胞增殖的意义。

3.3细胞的分化。（1）概念、特点、结果、实质、意义。（2）细胞的全能型：植物细胞、动物细胞、应用。（3）干细胞（概念、类型、特点、医学应用）。

3.4细胞的衰老。（1）过程。（2）特征。（3）原因。（4）与人体健康的关系。

3.5细胞的凋亡。（1）概念。（2）实例。（3）意义。（4）与人体健康的关系。

3.6细胞的癌变（由细胞的分化转变为细胞的癌变）。（1）癌细胞（概念、特征）。（2）癌变的机理。（3）致癌因子（物理、化W、病毒致癌因子）。（4）健康的生活方式与防癌。

结语：综上所述：思维导图法是一种教学意义上的新突破，也是历史潮流中发展的新突破。在高中生物教学实际运用上来说起到了不容小觑的作用，这就要求教师在高中生物教学中必须灵活的运用思维导图法来进行教学。一方面必须要遵循以教材为基础的理念完成思维导图教学；另一方面要结合学生实际特点和需要来完成思维导图教学；更加需要结合恰当的教学内容来对学生进行正确的教学引导。让学生能够发自内心的爱上生物、爱上学习、爱上学校。

参考文献：

[1]康虹丽.概念图和思维导图在高中生物教学中的应用前景[J].内蒙古教育：b，2015（2）：48-49.

生物细胞的定义范文篇5

牛磺酸(taurine)即2?氨基乙磺酸，是体内分布广泛、效应多样的自调素，它不但参与维持机体内环境稳定，而且对多种组织细胞有明显保护作用［1，2］。但其对肾脏系膜细胞是否有直接保护作用，国内外研究报道尚少。有研究表明，氧化低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,ox?LDL)在肾脏病变的发展中起重要作用，而血凝素样氧化低密度脂蛋白受体?1(Lox?1)是近年来发现的ox?LDL主要受体。因此，本研究观察牛磺酸对ox?LDL诱导的系膜细胞Lox?1表达及其抗氧化作用，初步探讨了其拮抗肾脏病变发生发展的可能作用机制。

1材料与方法

1．1试剂牛磺酸、HEPES购自美国Sigma公司；ox?LDL购自中国协和医科大学基础生化所；SOD、MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；低糖DMEM购自Gibsco公司；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；RNA抽提试剂盒购自Promega公司；RT?PCR试剂盒购自宝生生物工程大连有限公司；7225型紫外分光光度计为上海精密科学仪器有限公司生产；图像扫描仪为Fujifilm公司ImageMasterVDS产品。

1．2细胞系大鼠系膜细胞购自杭州市中医院肾病中心。细胞系用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养。

1．3方法

1．3．1细胞培养及分组：大鼠系膜细胞在含10％胎牛血清及HEPES的低糖DMEM培养液中贴壁生长。以每孔5×104个细胞总数接种到24孔培养板，待细胞达到80％左右，更换无血清培养基使细胞同步生长，将培养细胞随机分为4组：①正常对照组，只加无血清培养液；②ox?LDL组，无血清培养液加ox?LDL，浓度为50mg/L；③牛磺酸组，无血清培养液加牛磺酸，浓度为20mmol/L；④牛磺酸+ox?LDL组，无血清培养液中含终浓度为20mmol/L牛磺酸和50mg/Lox?LDL。每组设6个复孔，用药后继续培养24h，收集细胞上清液和细胞待检。

1．3．2RT?PCR检测细胞Lox?1mRNA表达：以Trizol试剂抽提细胞的总RNA，使用逆转录试剂盒，以oligoDT为引物，取总RNA2μg进行逆转录反应，之后以50μl反应体系进行体外PCR扩增，以β?actin作为内参。Lox?1引物序列为：正义5’?GACTGGATCTGGCATAAAGA?3’，反义5’?CCTTCTTCTTCTGACATATGCTG?3’，扩增产物大小为328bp；β?actin引物序列为：正义5’?TTCCAGCCTTCCTTCCTGG?3’，反义5’?TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT?3’，扩增产物大小为206bp，引物均由上海生物工程公司合成。反应条件：预变性94℃1min；然后进入94℃变性30s；55℃退火45s；72℃延伸1min，共35个循环；反应结束前72℃10min以充分延伸。PCR产物于1?5％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统拍照并进行半定量分析，β?actin值校正，得出目的条带与内参照条带的光密度比值。

1．3．3细胞上清液SOD、MDA水平检测：上述细胞用药后继续培养24h后收集培养液，2000r/min离心10min，取上清液在分光光度计上测定SOD、MDA，测定均依照

试剂盒说明操作。

．统计学处理计量资料以x±s表示，用SPSS?统计软件进行处理，组间比较用单向方差分析法（One?wayANOVA），P＜?表示有统计学意义。

结果

．ox?LDL诱导大鼠MCLox?mRNA的表达RT?PCR半定量检测表明，大鼠MC在ox?LDL刺激下Lox?mRNA的表达随着ox?LDL浓度增加而增强，在浓度为mg/L时表达水平最高（图）。

图不同浓度ox?LDL对大鼠MCLox?mRNA表达的影响略

．牛磺酸对ox?LDL诱导的大鼠MCLox?mRNA表达的影响mmol/L牛磺酸作用h后明显降低了ox?LDL诱导的大鼠MCLox?mRNA的表达（图）。

图牛磺酸对ox?LDL诱导的大鼠MCLox?mRNA表达的影响略

．牛磺酸对ox?LDL诱导的大鼠MC培养上清液中SOD活性、MDA含量的影响mmol/L牛磺酸作用h后SOD活性增加，同时MDA含量降低（表）。

表牛磺酸对ox?LDL诱导的大鼠MC培养上清液中SOD活性及MDA含量的影响(略)

讨论

血凝素样氧化低密度脂蛋白受体(Lox?)是近年来发现的ox?LDL的主要受体，首先被发现于血管内皮细胞［］，后来发现在巨噬细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和血小板中也有表达。在内皮细胞中的研究表明，ox?LDL可通过Lox?诱发内皮细胞ROS显著升高，特别是超氧阴离子和HO，激活NF?κB，减少NO生成，并可导致内皮细胞凋亡［4］。但是关于Lox?在其它细胞中的作用研究还较少，本研究检测Lox?在系膜细胞中的表达，结果显示Lox?也在系膜细胞上有微弱表达，受到ox?LDL诱导后表达明显升高，在一定浓度范围内随ox?LDL浓度的增加其表达也逐渐增加，但ox?LDL浓度达mg/L时Lox?表达又逐渐下降，推测这可能与ox?LDL的直接细胞毒性作用有关。该实验结果说明不仅对于内皮细胞而且对于系膜细胞而言，Lox?也是其结合或内吞ox?LDL的重要受体。牛磺酸是一种β?氨基酸的亚磺酸类似物，被认为是含硫氨基酸的无功能代谢产物。最近的研究显示，牛磺酸具有维持细胞内外渗透压平衡、稳定细胞膜、抗脂质过氧化损伤以及调节内皮舒张因子、内皮素等血管活性物质合成释放的紊乱状态［5］等多种作用，但其确切机制尚未完全明了。本实验研究了牛磺酸对Lox?表达的影响，结果显示，牛磺酸可以显著地降低ox?LDL诱导引起的Lox?基因表达水平。研究表明，ox?LDL作用于内皮细胞膜引起一系列过氧化链式反应，并产生大量的脂质过氧化物，这些脂质过氧化物不仅直接损伤细胞的DNA，诱导内皮细胞凋亡，而且作为一种重要的信使分子，介导多种细胞信号的转导；另有研究表明，牛磺酸对高血糖引起的血管内皮细胞的脂质过氧化损伤有明显的保护作用［6］。至于牛磺酸对ox?LDL所致的系膜细胞损伤，目前尚未见相关报道。本实验观察牛磺酸对ox?LDL诱导的系膜细胞自由基产生情况，结果表明，ox?LDL可使系膜细胞分泌MDA增多、SOD活性降低，而牛磺酸干预可使系膜细胞MDA含量显著下降、SOD活性增加，证实牛磺酸可抑制自由基产生从而保护系膜细胞，减轻ox?LDL对系膜细胞的损伤，进而延缓肾脏病变的发生、发展。

生物细胞的定义范文篇6

【关键词】二氧化硫

SO2被吸收进入体内后，首先在体液中转化成为它的代谢衍生物-亚硫酸盐和亚硫酸氢盐(分子比为3∶1)。SO2对动物和人的作用，实质上是通过这些体内衍生物对组织、细胞及生物大分子的损伤而达到的〔1，2〕。而细胞内许多抗氧化酶活性的改变和膜脂质过氧化的损伤一直被认为是许多毒物的作用机制之一。本室研究表明，SO2吸入可引起大鼠脑组织和红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性下降、脂质过氧化(LPO)作用增高〔3，4〕。SO2与人类健康关系密切，对其毒作用机制及防护研究非常重要。因此，本文研究了SO2体内衍生物对中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)中过氧化氢酶(CAT)、SOD酶活性及LPO水平的影响以及抗坏血酸(维生素C，VC)的保护作用。

1材料与方法

11实验材料CHL细胞（中国军事医学科学院提供）。

12细胞培养本实验所用CHL细胞在含5％CO2，37℃恒温箱中培养。用以细胞培养的RPMI1640(美国Gibco公司）培养液中含10％小牛血清，青霉素100Iu／ml，链霉素100μg／ml，传代时以02％胰酶液消化。

13药物处理

131SO2衍生物处理细胞传代，培养12h后进行药物处理：对照组5ml／瓶磷酸缓冲液，实验组分别用亚硫酸盐溶液处理，浓度分别为5，10，15，20mmol／L，4h后，弃去处理液。用磷酸缓冲液洗涤细胞，换上新鲜培养液，细胞仍置于5％CO2，37℃恒温箱中培养。分别在12，24h取上清液用于脂质过氧化水平测定；并分别在12，24，36，48h取各组细胞消化，1250r／min离心10min，加入5ml超纯水溶解细胞，置-80℃冰箱中，冻融二次，取出并破碎细胞，进行酶活性测定。

132VC处理细胞传代，培养12h后进行药物处理：对照组5ml／瓶磷酸缓冲液，实验组分别用不同剂量VC和磷酸缓冲液处理，VC剂量分别为005，01，025，05mmol／L，4h后，弃去处理液。将其分为3组，1组细胞经消化、离心、破碎后立即测定酶活性；另外2组用磷酸缓冲液洗涤细胞，换上新鲜培养液，将细胞置于5％CO2，37℃恒温箱中培养。分别在12，24h取上清液测定脂质过氧化水平，并测定各组细胞酶活性。

133SO2衍生物和VC处理细胞传代，培养12h后进行药物处理，先用01mmol／L的VC处理15min后，加入不同剂量的SO2衍生物，浓度为5，10，15，20mmol／L，4h后，弃去处理液，分别在12，24h测定脂质过氧化水平和酶活性。

14CAT活性测定采用过氧化氢(H2O2)分解反应的一级速率常数来测定CAT的活性〔5〕。即在一定的时间间隔Δt内测定H2O2在240nm处的吸光度A1、A2，并用下列公式计算：K/g蛋白质=23／Δt(a／b×lgA1/A2）(Sec-1)。式中：K-速率常数；Δt-时间间隔；a-稀释倍数；b-溶液中蛋白质含量；A1、A2分别-时间t1、t2时的吸光度。

15SOD活性测定采用改进的VC终止法，420nm测A值〔3，4〕。邻苯三酚自氧化率的A值控制在006～007／min。SOD活性以单位／mg(蛋白质)(U／mgprotein)表示。

16脂质过氧化作用的测定通过测定硫代巴比妥酸反应物（TBARS)的水平，以1，1，3，3-四乙氧基丙烷为标准，计算脂质过氧化产物-TBARS的含量〔3，4〕。主要步骤为：在样品反应管中加入4ml10％三氯乙酸，16ml067％硫代巴比妥酸(TBA)，细胞上清液04ml，在95～100℃保温40min，水浴冷却后，3000r／min离心10min，取上清液在532nm测A值。

17蛋白质含量测定采用Lowry法进行蛋白质含量的测定〔3，4〕。

18统计分析应用t检验法检验实验组与对照组之间的差异。

2结果

21SO2衍生物对CHL细胞CAT活性的影响(表1)如表1所示，实验组细胞在12，24h时酶活性都显著降低。其中5mmol／L组随着时间的延长，细胞酶活性逐渐恢复。而10，15，20mmol／L组细胞却随时间延长而降低，在36h时酶活性显著降低。在48h时，酶活性有所回升，5，10mmol／L组已分别恢复到对照组的93％和83％，15和20mmol／L组也比36h时稍有升高，但与对照组比较，差异有统计学意义(P

表1不同浓度SO2衍生物对CHL细胞CAT活性的影响（略）

注：aP

22VC对CHL细胞CAT活性的影响在VC处理4h后弃去处理液，立即测定CAT活性，0，005，01，025，05mmol／L组的计算值分别为(0060±0，002），（0060±0000)，（0063±0004），（0058±0001），（0059±0001），实验组与对照组比较，差异无统计学意义；继续培养12h后，CHL细胞CAT活性明显升高，5个剂量组的计算值分别为（0059±0001），（0065±0001），（0072±0002），(0066±0005），(0068±0005），实验组与对照组比较，差异有统计学意义（P

23VC对SO2衍生物引起的CHL细胞CAT活性变化的干预(表2)如表2所示，VC和SO2衍生物共同作用后，CAT活性仍然呈下降趋势。但在培养12h的细胞中，加入VC的5，10mmol／L组都显著高于未加VC组的CAT活性；在培养24h的细胞中，10，15mmol／L组与未加VC组差异有统计学意义(P

表2VC对SO2衍生物引起的CHL细胞CAT活性变化的干预（略）

注：与阴性对照组比较，aP

24CHL细胞中SOD的测定本实验中，对照组和SO2衍生物处理组均未能检测到SOD的存在。这可能是由于CHL细胞中没有SOD，也可能是由于含量低而无法用本实验的方法检测。

25SO2衍生物对CHL细胞脂质过氧化的影响（表3）如表3所示，SO2衍生物处理后细胞脂质过氧化水平均有增高，处理12h时10，15mmol/L与对照组比较，差异有统计学意义，20mmol／L组与对照组比较，差异有统计学意义(P

表3VC对SO2衍生物引起的CHL细胞LPO变化的干预（略）

注：与阴性对照组比较，aP

26VC对SO2衍生物引起的CHL细胞LPO变化的干预如表3所示，VC和SO2衍生物共同作用后，12和24h时各组细胞脂质过氧化水平随SO2衍生物浓度增高仍然呈上升趋势，且12h时，15和20mmol／L组与对照组比较，差异有统计学意义（P

27VC对CHL细胞脂质过氧化的影响VC处理12h时，CHL细胞脂质过氧化水平均有不同程度的降低，0，005，01，025，05mmol／L组的计算值分别为（0387±0002)，(0376±0017)，(0328±0015)，(0356±0005)，(0376±0011)nmol／ml，且010，025mmol／L组与对照组比较，差异有统计学意义(P

3讨论

SO2进入体内后，主要以SO2-3和HSO-3的形式发挥其生物学作用。而后者极易形成三氧化硫阴离子自由基(SO-·3)，进而形成过氧自由基(O-2）、羟自由基(OH·)等〔6〕。CAT中含有巯基(-SH)，易受自由基攻击〔7，8〕，自由基还攻击生物膜使不饱和脂肪酸发生过氧化〔9〕。本实验以SO2代谢衍生物对CHL细胞进行处理后，发现CAT活性降低，LPO水平增高，呈现一定的剂量-效应关系。从而进一步验证了SO2的自由基损伤学说〔10〕。本实验未能检测到SOD，其原因有待进一步研究。EtlikOzdal等研究表明，VC、维生素E（VE）对SO2引起的红细胞脂质过氧化有保护作用〔11〕。本实验研究发现，VC单独处理后，各组CAT活性只在12h时显著升高，同时LPO水平降低，但是只有010，025mmol／L组与对照组比较，差异有统计学意义。可见，一定剂量的VC在一定时间范围内可以增强CHL细胞抗氧化酶的活性，并降低其脂质过氧化水平。VC和SO2共同作用后，CAT活性仍然呈下降趋势，但添加VC的组CAT活性普遍高于相应的未加VC组，且培养12h时5，10mmol／L组及24h时10，15mmol／L组与未加VC差异有统计学意义，且VC也降低了SO2衍生物引起的LPO水平，且12h时10，15，20mmol／L组比未加VC组有显著降低。说明VC对SO2衍生物所造成的CAT活性降低和LPO水平增高有一定的影响作用。

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生物细胞的定义范文

【摘要】目的:构建人IL8正义和反义真核表达载体。方法:RTPCR扩增正义和反义IL8基因片段后，将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)，通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定后，采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞中，并用RTPCR和ELISA法检测细胞转染后IL8的表达水平。结果:经验证，重组人IL8正义/反义真核表达载体构建正确。pcDNA3.1(+)ssIL8转染A2780细胞后，其IL8mRNA及蛋白表达水平均显著增加;而pcDNA3.1(+)asIL8转染SKOV3细胞后，其IL8分泌水平降低。结论:成功构建了人IL8正义/反义真核表达质粒pcDNA3.1(+)ssIL8/pcDNA3.1(+)asIL8，为后续研究IL8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础。

【关键词】IL8;正义/反义;真核表达载体;卵巢癌细胞

[Abstract]AIM:ToconstructthesenseorantisenseIL8eukaryoticexpressionvectors.METHODS:SenseorantisenseIL8fulllengthgenewereamplifiedbyRTPCRandclonedintoeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+).AftertheidentificationbyPCR，restrictionendonucleasedigestionandthenucleotidesequencing，therecombinantvectorsweretransfectedintohumanovariancarcinomaA2780andSKOV3celllinestransientlybylipofectaminemediation.TheexpressionofIL8geneandproteinweredetectedbyRTPCRandELISA.RESULTS:ThesenseorantisenseIL8eukaryoticexpressionvectorswereconstructedandverified.TheexpressionofIL8geneandproteininA2780cellstransfectedwithpcDNA3.1(+)ssIL8wereincreased，whereastheexpressionofIL8proteininSKOV3cellstransfectedwithpcDNA3.1(+)asIL8wasdecreased.CONCLUSION:TheeukaryoticexpressionvectorspcDNA3.1(+)ssIL8orpcDNA3.1(+)asIL8havebeenconstructedsuccessfully，whichlaysabaseforfurtherstudyonrolesofIL8inovariancancerandothertumors.

[Keywords]IL8;senseorantisense;eukaryoticexpressionvector;ovariancarcinomacells

IL8是一种多功能的趋化因子，可参与多种恶性肿瘤的生长、转移及血管生成。近年来研究表明[1，2]，IL8在卵巢癌中高表达，其高表达可能与卵巢癌发生、发展及化疗关系密切。我们前期研究发现[3，4]，IL8及雌、雄激素均可促进卵巢癌细胞增殖;IL8还可在无雌、雄激素的条件下调节卵巢癌细胞表达雌、雄激素的受体，从而增加该细胞对两种激素的敏感性。为了深入探讨IL8在卵巢癌发生、发展及化疗和内分泌治疗中的作用及作用机制，我们应用基因重组技术，成功构建人IL8正义(sense，ss)和反义(antisense，as)真核表达载体，从而为后续研究IL8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用及作用机制奠定基础。

1材料和方法

1.1材料TOP10感受态细菌购自北京天根生物公司;真核表达载体pcDNA3.1(+)为美国Invitrogen公司产品，由本室保存。人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3细胞均为美国ATCC公司产品，由本室保存。RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品;2×PremixTaq、MMLV逆转录酶、BamHⅠ、XhoⅠ为TaKaRa公司产品;T4DNA连接酶为美国NEB公司产品、DNA胶回收试剂盒为加拿大BioBasic公司产品;人IL8ELISA试剂盒为美国R&D公司产品;OptiMEMⅠ、LipofectamineTM2000、TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品;100bp和1kbDNAMarker、高纯度质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司。

1.2方法

1.2.1引物设计人IL8全长编码基因扩增用引物，参照GenBank数据库(NM000584.2)，采用DNAMAN软件设计，senseIL8引物，F:5′CTCGGATCCATGACTTCCAAGCTGGCCGTG3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点)，R:5′AGACTCGAGTTATGAATTCTCAGCCCTCTT3′(划线部分为XhoⅠ酶切位点);目的片段318bp。antisenseIL8引物，F:5′CTCGGATCCATGTGAATTCTCAGCCCTCTT3′(划线部分为BamHⅠ酶切位点)，R:5′AGACTCGAGTTAACTTCCAAGCTGGCCGTG3′(划线部分为XhoⅠ酶切位点)，目的片段318bp。

1.2.2目的基因的扩增自SKOV3细胞中提取总RNA作为逆转录模板，采用RTPCR方法扩增IL8正义全长目的基因片段。逆转录反应条件参照TaKaRaMMLV逆转录酶说明书进行，逆转录产生的cDNA经PCR扩增获得约300bp大小的目的片段(引物序列见1.2.1)。50μLIL8正义PCR产物经12g/L琼脂糖凝胶电泳后，按照DNA胶回收试剂盒说明回收纯化DNA片段。以此纯化的IL8正义PCR产物为模板，扩增IL8反义全长目的基因片段(引物序列见1.2.1)。PCR反应体系:cDNA0.5μL，2×PremixTaq25μL，上、下游引物各25pmol，加双蒸水至总体积50μL。PCR反应条件:94℃5min预变性;94℃30s变性，59℃45s退火，72℃1min延伸，34个循环;72℃延伸10min。

1.2.3重组质粒的构建空载体pcDNA3.1(+)、IL8正义或反义PCR纯化回收产物分别用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，经电泳回收目的条带后定量。按照目的片段和载体片段摩尔比为3∶1的原则，用T4DNA连接酶将双酶切后的目的片段和空载体进行连接，而后转化入TOP10感受态细菌。将转化细菌均匀涂布于含氨苄青霉素50mg/L的LB琼脂平板上，倒置于37℃温箱培养12h(过夜)。

1.2.4重组质粒的鉴定挑取孤立菌落，用100μL去离子水重悬，作为模板，进行菌落PCR扩增鉴定。PCR反应体系为:菌落1μL，2×PremixTaq10μL，上、下游引物各10pmol(引物序列见1.2.1)，加双蒸水至总体积20μL。PCR反应条件同1.2.2。经菌落PCR鉴定阳性的单菌落，接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB液体培养基中，37℃恒温摇床震荡培养过夜，按照质粒小量提取试剂盒说明提取质粒，并用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定。经菌落PCR和酶切鉴定证实有插入片段后，将阳性菌液2mL送北京天根生物公司测序，将测序结果正确的重组载体分别命名为pcDNA3.1(+)ssIL8和pcDNA3.1(+)asIL8。

1.2.5细胞瞬时转染采用脂质体法将重组载体pcDNA3.1(+)ssIL8或pcDNA3.1(+)asIL8及空载体pcDNA3.1(+)分别导入A2780细胞和SKOV3细胞中。按照脂质体LipofectamineTM2000说明书进行，具体步骤如下:用无抗生素、含100mL/LFBS的RPMI1640培养液调整细胞密度为2×108/L，每孔2mL加入6孔板，37℃、50mL/LCO2培养过夜。待细胞生长至80%融合时，更换新鲜的无抗生素、含100mL/LFBS的RPMI1640培养液。准备A、B两液，A液:250μLOptiMEMⅠ，加入4μg重组载体或空载体，轻混;B液:250μLOptiMEMⅠ，加入10μL脂质体，轻混后室温放置5min。上述两液混合后，室温放置20min，加入到每孔细胞中，37℃、50mL/LCO2培养6h后，更换无抗生素、含100mL/LFBS的RPMI1640培养液，每孔2mL。转染细胞分别命名为pcDNA3.1(+)/A2780、pcDNA3.1(+)ssIL8/A2780和pcDNA3.1(+)/SKOV3、pcDNA3.1(+)asIL8/SKOV3。

1.2.6细胞转染后IL8表达水平的检测转染后24h，采用ELISA法检测上清中IL8的含量;同时收集细胞，抽提RNA后分别以IL8的特异性引物进行RTPCR反应。引物序列如下:IL8，F:5′AACATGACTTCCAAGCTGGCCG3′，R:5′CAGTTTTCCTTGGGGTCCAGAC3′，目的片段251bp;内参照GAPDH，F:5′CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA3′，R:5′ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA3′，目的片段450bp。PCR反应体系:cDNA1.0μL，2×PremixTaq10μL，上、下游引物各10pmol，加双蒸水至总体积20μL。PCR反应条件:94℃5min预变性;94℃30s变性，59℃45s退火，72℃1min延伸，34个循环;72℃延伸10min。反应结束后，取PCR反应液5μL于12g/L琼脂糖凝胶电泳。

2结果

2.1正义和反义IL8全长基因片段扩增以SKOV3细胞的总RNA为模板，应用前述引物进行RTPCR，将扩增产物进行12g/L琼脂糖凝胶电泳(图1)，可见300bp左右单一条带，与预计片段长度(318bp)相符。

2.2重组载体的构建与鉴定目的片段和空载体分别经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，按照目的片段与空载体的摩尔比为3∶1进行连接反应，连接产物进行转化并过夜培养，次日可见阳性菌落形成。挑选独立阳性菌落进行PCR扩增后，可见约300bp的条带(图2)。挑取PCR鉴定阳性的菌落摇菌，提取质粒DNA后进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定(图3)，可见约5.3kb和300bp左右的片段出现，说明真核表达载体pcDNA3.1(+)上已成功插入了ssIL8或asIL8全长编码基因。对阳性克隆中的插入片段进行序列测定，结果显示，所克隆的基因与GenBank数据库中人IL8的正义及反义全长序列完全一致。

2.3RTPCR技术检测IL8mRNA在A2780细胞中的表达与对照A2780细胞和pcDNA3.1(+)/A2780细胞相比(图4)，pcDNA3.1(+)ssIL8/A2780细胞的IL8mRNA的表达水平明显增高，而未转染细胞和转染空载体细胞之间差别不大。

2.4ELISA法检测IL8蛋白在A2780和SKOV3细胞中的表达转染正义IL8的pcDNA3.1(+)ssIL8/A2780细胞的IL8蛋白表达水平为(1.043±0.004)μg/L，明显高于转染空载体的pcDNA3.1(+)/A2780细胞(0.010±0.001)μg/L(P

3讨论

IL8是一种多功能的趋化性细胞因子，有学者认为IL8具有激活嗜中性粒细胞聚集到肿瘤局部，对肿瘤细胞起杀伤和抑制作用;而多数学者认为，IL8能促进肿瘤的生长和转移，其机制主要是通过作为自分泌生长因子、血管发生因子和促进Ⅳ型胶原酶的活性以及影响细胞的黏附移动，从而促进肿瘤的发生、发展和转移。IL8在多数肿瘤组织中高表达，而在其相应的正常组织却不表达或低表达[5]。研究表明，卵巢癌患者高表达IL8，其腹水中表达水平明显高于血清[1]。应用免疫组化技术发现，卵巢癌患者局部肿瘤组织中的IL8高表达与肿瘤的进展程度及不良预后有关[2]。从卵巢癌细胞系HeyA8分离出的IL8高分泌克隆HeyA8(H)的增殖率明显高于低分泌克隆HeyA8(L)，IL8可促进HeyA8(L)克隆的增殖，而IL8的中和抗体可降低HeyA8(H)克隆的增殖;应用IL8表达载体转染的HeyA8(L)克隆以增强IL8的表达后，可明显促进肿瘤细胞的增殖、微血管密度以及后来的肿瘤形成[6]。IL8还可封闭TNF相关凋亡诱导配体(TNFrelatedapoptosisinducingligand，TRAIL)诱导的细胞死亡，并且能使TRAIL敏感的细胞系转变为TRAIL抗性细胞系，表明IL8在保护卵巢癌细胞逃避TRAIL介导的凋亡中起重要作用[7]。此外，IL8表达可影响卵巢癌对化疗的敏感性。应用基因芯片技术分析发现，紫杉醇耐药卵巢癌细胞的IL8mRNA及蛋白表达均增加。Penson等报道[1]，卵巢癌患者在紫杉醇治疗前给予甾体类抗雌激素治疗则血清中IL8水平下降，紫杉醇治疗后24h则其水平上升。这一结果与早期Lee等人体外研究发现的紫杉醇可诱导人卵巢癌细胞的IL8转录和分泌的结果相一致。目前有关IL8诱导卵巢癌细胞对化疗药物产生耐药的机制尚不十分清楚。

我们以往的研究证明人卵巢癌细胞系SKOV3可组成性高表达IL8[5，8]，而本研究证实，另一种人卵巢癌细胞系A2780中的IL8表达水平极低。提示这两种卵巢癌细胞可作为研究IL8在卵巢癌中作用及作用机制的一个良好模型。本研究首先从高表达IL8的SKOV3细胞中提取总RNA并以此为模板，根据人IL8的全长编码区基因序列设计并合成ssIL8和asIL8两对引物，通过RTPCR获得318bp大小的目的片段即正义和反义IL8全长编码基因，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，由此构建了重组载体pcDNA3.1(+)ssIL8和pcDNA3.1(+)asIL8，后经菌落PCR、双酶切及核苷酸测序，证实所获片段和目的片段序列完全一致。最后应用脂质体法将IL8正义和反义表达载体分别导入低表达IL8的A2780细胞和高表达IL8的SKOV3细胞中，并用RTPCR和ELISA法检测细胞转染后IL8的表达水平，发现IL8的表达量具有明显差异，从而达到了预期的试验目的。总之，人IL8正义和反义真核表达载体的成功构建，将为我们后续研究IL8在卵巢癌发展及化疗、内分泌治疗中的作用与作用机制奠定基础，同时也为研究其他高表达IL8的恶性肿瘤提供参考。

参考文献

[1]PensonRT，KronishK，DuanZ，etal.CytokinesIL1beta，IL2，IL6，IL8，MCP1，GMCSFandTNFalphainpatientswithepithelialovariancancerandtheirrelationshiptotreatmentwithpaclitaxe[J].IntJGynecolCancer，2000，10(1):33-41.

[2]MerrittWM，LinYG，SpannuthWA.Effectofinterleukin8genesilencingwithliposomeencapsulatedsmallinterferingRNAonovariancancercellgrowth[J].JNatlCancerInst，2008，100(5):359-372.

[3]王越，杨洁，高燕，等.IL6、IL8上调卵巢癌细胞雄激素受体表达的作用分别依赖MAPK途径和Src活化[J].免疫学杂志，2008，24(4):424-429.

[4]WangY，YangJ，GaoY，etal.Reciprocalregulationof5alphaDihydrotestosterone，Interleukin6andInterleukin8duringproliferationofepithelialovariancarcinoma[J].CancerBiolTher，20076(6):864-871.

[5]MasuyaD，HuangC，LiuD，etal.Theintratumoralexpressionofvascularendothelialgrowthfactorandinterleukin8associatedwithangiogenesisinnonsmallcelllungcarcinomapatients[J].Cancer，2001，92(10):2628-2638.

[6]PoszepczynskaE，MartinvaletD，BoulocA，etal.ErythrodermiccutaneousTcelllymphomawithdisseminatedpustulosis.Productionofhighlevelsofinterleukin8bytumorcells[J].BrJDermatol，2001，144(5):1073-1079.

生物细胞的定义范文篇8

论文摘要：目的：探讨桂枝茯苓丸诱导肿瘤细胞凋亡机制，为桂枝茯苓丸(GFW)开发应用提供实验依据。方法：计算抑瘤率，流式细胞仪测定细胞凋亡率，电镜观察肿瘤细胞超微结构。原位杂交法检测SurvivinmRNA表达。结果：GFW抑瘤率为38.93％，流式细胞仪检测GFW组凋亡率17.79％，与模型组比较，差异有统计学意义。GFW组镜下可见瘤细胞以凋亡变化为主。内膜结构完好，核膜清晰，细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，并可见凋亡小体。GFW下调肿瘤细胞SurvivinmRNA表达，与模型组比较，差异有统计学意义。结论：GFW诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能与下调SurvivinmRNA表达密切相关。

中医认为血瘀是肿瘤的主要成因之一，桂枝茯苓丸是一活血化瘀方剂，广泛用于各种血瘀症的治疗，临床实践证明具一定的抑瘤作用，但对其抑瘤机理的研究并不深入。本文选用荷瘤小鼠作为研究对象，观察桂枝茯苓丸(GFW)对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，以其从分子水平上探讨GFW抗肿瘤效应机理，为GFW的临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1．1主要仪器和试剂原位杂交试剂盒购白天津灏洋生物技术有限公司。OLYMPUS显微镜(日本)、HITACHI－H500型透射电镜(德国菲利蒲公司)、FACSCALIBUR流式细胞仪(美国BD公司)、SB651旋转蒸发仪(日本RIKAKI公司)、HIMAS－2000多媒体彩色病理图文分析系统(同济医大)。

1．2实验动物40只昆明小鼠，体重(20±2)g，雄性，由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。

1．3瘤株S180瘤株，由黑龙江省肿瘤研究所提供

1．4药物桂枝茯苓丸：按《金匮要略》记载标准，生药均购自齐齐哈尔市中医院。桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍各药等量，加适量水，浸泡2h，先文火后武火煎煮2次，经过滤除渣后，水浴浓缩，配成1g/mL的水煎剂，置4℃保存备用。

环磷酰胺(Cylophosphamide，CY)，山西普德药业有限公司出品，批号H14023686。

1．5动物模型取腹腔接种10天的荷瘤小鼠，在无菌条件下抽取腹水(乳白色，黏稠)，放入无菌容器内，置冰块保存。用0.4％台盼蓝生理盐水液计数(计活细胞大于95％)，用生理盐水调细胞浓度至5×106/mL。取KM小鼠30只，每只鼠右侧腋下皮下注射0.2mL瘤细胞悬液。

1．6动物分组及给药方法将荷瘤鼠随机分为3组，每组10只，分别为模型组、实验组、CY组，另取10只未荷瘤小鼠作为正常对照。模型组(Modelgroup)：生理盐水灌胃0.2mL/(10g·d)；中药组(GFWgroup)：GFW灌胃0.2mL/(10g·d)；环磷酰胺组(CYgroup)：腹腔注射CY20mg/(kg·d)。接种后次日给药，各组每天给药1次，连续10天。

1．7细胞凋亡的检测(流式细胞仪－单激光单染色法)小鼠脱颈处死，无菌取腋下实体瘤，常规制备瘤细胞悬液，调整浓度1×106/mL，1500r/min离心5min，弃上清，PBS洗1次，加70％冷乙醇1mL，4℃固定30min。离心5min，弃上清，PBS洗2次。加50mg/mLPI染液600mL染色，30min后上机测定。

1．8透射电镜观察形态学改变每组随机取2块瘤组织，将瘤组织快速投入2.5％戊二醛固定液固定2h以上，磷酸缓冲液漂洗，1％锇酸后固定1－2h，缓冲液漂洗20min，丙酮梯度脱水，浸透、包埋、制备超薄切片，醛酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电镜观察并拍片。

1．9原位杂交瘤组织及时固定，切片常规脱蜡至水。3％H2O2室温封闭10min，PBS洗，暴露mRNA核酸片段，滴加预杂交液20μL，40℃3h，不洗，Survivin探针杂交液20μL，滴加40℃杂交过夜，杂交后洗涤，滴加生物素化抗地高辛37℃60min，原位杂交用PBS洗5min×4次，滴加高敏过氧化物酶链亲和索复合物工作液，37℃60min，原位杂交用PBS洗5min×4次，DAB显色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。本实验设2张阴性对照片，1张用PBS代替探针，1张用PBS代替生物素化抗地高辛。

1．10统计方法Survivin结果利用HIMAS－2000多媒体全自动图像分析仪检测，所得数据经SPSS11.0系统处理，采用OneWayANOVA法，两两比较用SNK法。结果用x±s表示。

2结果

2．1抑瘤率与模型组比较，GFW组、CY组瘤重低于模型组瘤重，差异有统计学意义(P＜0.05)。GFW组与CY组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。GFW组抑瘤率为38.93％。

2．2肿瘤细胞凋亡率GFW组肿瘤细胞凋亡率为17.79％，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2．3肿瘤细胞电镜观察模型组瘤细胞的核浆比大，双层核膜清晰，核异形性明显，瘤细胞表面可见丰富微绒毛，胞质内线粒体轻度肿胀，核周可见幼稚高尔基复合体及内质网，游离核蛋白体丰富，有少量的淋巴细胞浸润。中药组镜下可见瘤细胞以凋亡变化为主。瘤细胞体积明显变小，细胞表面微绒毛减少甚至消失，内膜结构完好，核膜清晰，细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，并可见凋亡小体。游离核蛋白体减少非常明显，线粒体嵴断裂，空泡变性，胞质内可见大量的脂肪堆积；同时可见大量粒细胞侵润并伴有坏死。

2．4肿瘤细胞中Survivin基因mRNA表达原位杂交法对Survivin基因mRNA表达进行半定量检测。染色结果Survivin基因表达定位于胞质呈棕黄色，弥漫性分布。在10×40倍高倍镜下，每张标本随机选择5个视野，精确选取视野内所有的阳性颗粒，利用HIMAS－2000多媒体图像分析系统对Survivin各组原位杂交反应阳性细胞面密度值、阳性细胞平均灰度值进行分析。与模型组比较，GFW组与CY组Survivin基因mRNA表达降低(P＜0.01)，GFW组与CY组比较，Survivln基因mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)。提示GFW可下调肿瘤细胞内凋亡相关基因SurvivinmRNA量。

3讨论

通过应用各种不同的药物影响信号传导途径，从而触发或重建整个死亡程序，使处于关闭状态的凋亡信号传导各效应环节迅速连通，诱导程序化细胞死亡反应，为肿瘤治疗开辟了新思路。细胞凋亡信号传导的大致过程是：细胞整合各种胞内外凋亡信号，通过细胞凋亡信号与其受体形成的复合物经胞浆信号转导蛋白传递至一组细胞凋亡的执行者caspases，再由激活的easpases对其特异性底物进行降解，最终导致细胞凋亡。本实验经流式细胞仪检测表明，GFW可促进荷瘤小鼠体内肿瘤细胞发生凋亡，凋亡率为17.79％。透射电镜观察GFW组瘤细胞以凋亡变化为主。瘤细胞体积明显变小，细胞表面微绒毛减少甚至消失，内膜结构完好，核膜清晰，细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，并可见凋亡小体。进一步证明了桂枝茯苓丸的抗肿瘤作用机理和诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。

生物细胞的定义范文篇9

[关键词]青光眼；小梁网细胞；内质网应激

[中图分类号]R775[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2016）01（c）-0114-04

ExpressionandclinicalsignificanceofGRP78inhumantrabecularmeshworkcells

CHAIFang1ZHUOYehong2YANGXinguang1

1.DepartmentofOphthalmology，Xi'anNo.4HospitalOphthalmicMedicalCenterofShaanxiProvinceGuangrenHospitalAffiliatedtoSchoolofMedicine，Xi'anJiaotongUniversity，ShaanxiProvince，Xi'an710004，China；2.ZhongshanOphthalmicCenter，SunYat-SenUniversityStateKeyLaboratoryofOphthalmology，GuangdongProvince，Guangzhou510060，China

[Abstract]ObjectiveTodetectproteinandmRNAexpressiondifferencesofGRP78inhumantrabecularmeshworkcellsofnormaleyes（NTM）andPOAGpatients（GTM）invitro.MethodsHumantrabecularmeshworkcellsfromNTMandGTMinvitroweredividedinto3groups：Tunicamycin（Tm）group，Staurosporine（STS）groupandcontrolgroup.Real-timeRT-PCRandWesternblotwereusedtodetecttheexpressionofmRNAandproteinofGRP78intrabecularmeshworkcellsafter6，24htreatment.ResultsTheexpressionofGRP78inprimarycultureGTMcellswassignificantlylowerthanthatinNTMcells，withstatisticallysignificantdifference（P<0.05）.TmcouldincreasetheexpressionofGRP78inNTMandGTMcells，theexpressioninGTMcellswaslowerthanthatinNTMcells，withstatisticallysignificantdifference（P<0.05）.TheresponseofGTMcellsforSTSwasbiggerthanNTMcells.ConclusionGTMsshowedinsensitivityreactionswhenstimulatedwithinducerofendoplasmicreticulumstress，reducetheexpressionofGRP78，leadtotheincreasedsensitivityofGTMstodamagestimulus.GRP78mayplayacytoprotectiveroleintheapoptosisintrabecularmeshworkcellscausedbyendoplasmicreticulumstress.

[Keywords]Glaucoma；Trabecularmeshworkcells；Endoplasmicreticulumstress

青光眼为全球主要不可逆性致盲眼病，原发性开角型青光（primaryopen-angleglaucoma，POAG）是青光眼中的常见类型，其发病机制未明[1]。内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）是近年新崛起的青光眼发病机制研究热点。葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulatedprotein78，GRP78）作为ERS的关键伴侣蛋白，其高表达是细胞对病理应激的重要防御机制之一[2-3]。近几年国内外广泛开展针对GRP78的作用机制研究，提出2型糖尿病、肿瘤患者细胞内GRP78呈高表达[4-6]。同时研究表明，GRP78对敏感神经元、缺氧晚期心脏组织具有保护作用，可抑制肝细胞内脂肪合成等[7-8]，其功能研究已引起生物学家们的广泛重视。本研究通过体外培养正常人小梁网细胞（NTM）及POAG患者小梁网细胞（GTM），采用衣霉素（Tunicamycin，Tm）、十字孢碱（Staurosporine，STS）药物处理细胞，运用Real-timePCR、蛋白质印迹（Westernblot）等方法检测GRP78mRNA及蛋白的表达，发现GTM细胞中GRP78表达下调，对ERS的反应能力下降，对损伤性刺激的敏感性增强，最终导致功能异常和细胞凋亡。现将结果报道如下：

1材料与方法

1.1药品与试剂

DMEM/F12培养基购于Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、衣霉素（Tunicamycin，Tm）、十字孢碱（Staurosporine，STS）购于美国Sigma公司，逆转录试剂盒购于Fermentas公司，Westernblot检测试剂盒购于CellSignaling公司。

1.2实验分组

收集健康供体及青光眼患者小梁网组织进行原代培养并进行传代[9]。将第3代小梁网细胞接种于25cm2培养瓶底，DMEM-F12培养液（含质量分数15%胎牛血清，60mg/L青霉素，100mg/L链霉索）培养。将NTM、GTM细胞接种于培养瓶，待细胞完全融合后，分别加入含有1μmol/LTm培养液、0.1μmol/LSTS培养液和不含上述任何药物的培养液，分为Tm组、STS组、对照组，每天换液，处理6～24h。采用Real-timePCR、Westernblot方法检测药物处理6、24h后小梁网细胞中GRP78mRNA及蛋白的表达。

1.3RNA提取和RT-PCR

样品总RNA提取：培养瓶中加入Trizol，吹打后移入离心管，振荡器混匀。加入氯仿，混匀、静置分层后，离心转上清于另一离心管中，加等体积异丙醇，离心后弃上清，加预冷的75%乙醇，再次离心后弃上清，ddH2O溶解沉淀。取RNA样品，检测RNA在230、260、280nm处的吸光度，确定其质量、浓度；再进行琼脂糖电泳，检测RNA完整性；依Fermentas逆转录试剂盒程序进行逆转录。将上述逆转录所得DNA进行扩增，得到目的片段，从而在mRNA水平检测小梁网细胞GRP78的表达。采用DNA琼脂糖凝胶电泳，用四星图像分析系统对凝胶各泳道中的目的条带和内参条带进行光密度扫描，定量分析。实验重复3次。

1.4Westernblot检测

根据Westernblot检测试剂盒说明提取细胞膜蛋白进行10%聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，依次将Maker、各蛋白样品加入梳孔内，Maker上样量为5μL，其余每孔上样量为20μL（含总蛋白30μg），电压为恒压200V，待溴酚兰指示剂跑至分离胶下缘时，停止电泳，再经转膜、封闭，一抗、二抗封闭后进行曝光检测，最后再入定影液10min，清水漂洗，晾干。用四星图像分析系统对免疫印迹结果进行定量分析。

1.5统计学方法

应用SPSS16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；相关性分析用Pearson检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1GRP78mRNA在人眼小梁网细胞中的表达

结果显示，GTM细胞GRP78mRNA表达水平较NTM细胞低，经Tm、STS药物处理后，表达差异仍有统计学意义（P<0.05）；Tm处理后，NTM、GTM细胞内GRP78mRNA表达水平均上调，并且上调呈时间依赖性，最高表达量出现在Tm刺激24h后；STS处理细胞后，NTM细胞内GRP78mRNA表达水平在6、24h均上调，而GTM细胞内GRP78mRNA表达水平在6h上调，24h下调。Tm、STS药物处理后，细胞内GRP78表达变化量与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、图1。

表1各组GRP78mRNA相对表达量比较（x±s）

注：与NTM比较，*P<0.05，与对照组比较，#P<0.05；Tm：衣霉素；STS：十字孢碱；NTM：正常人小梁网细胞；GTM：患者小梁网细胞

2.2GRP78蛋白在人眼小梁细胞中的表达

结果显示，各组小梁细胞均有GRP78蛋白表达，GTM较NTM细胞表达水平低，经Tm、STS药物作用24h后GTM细胞GRP78蛋白的表达量明显较NTM细胞低（P<0.05）；Tm处理细胞后，NTM、GTM细胞内GRP78蛋白表达量均上调，并且呈时间依赖性，最高表达量出现在Tm刺激24h；STS处理细胞后，NTM细胞内GRP78蛋白在药物处理6h时上调，在药物处理24h时下调；而GTM细胞内GRP78蛋白表达量均下调，下调量在STS刺激细胞24h时表达最明显。Tm、STS药物处理细胞后，GRP78蛋白表达变化量与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2、图2～3。

表2各组GRP78蛋白相对表达量比较（x±s）

注：与NTM比较，*P<0.05，与对照组比较，#P<0.05；Tm：衣霉素；STS：十字孢碱；NTM：正常人小梁网细胞；GTM：患者小梁网细胞

3讨论

POAG占所有青光眼的85%～90%，小梁网部位房水外流阻力增大所造成的病理性眼压升高是引起青光眼视神经损害的重要原因。小梁网细胞的丢失势必影响小梁网的结构和功能，从而影响房水流出的效率，因而关于小梁网细胞凋亡的研究已成为探索开角型青光眼发病机制和治疗手段的有效方法之一[10-12]。

ERS是细胞内质网稳定失衡、生理功能发生紊乱时，细胞为维持细胞内环境稳定而保持细胞生存启动的自我保护反应机制[13-15]。ERS可促进内质网腔中未折叠或错误折叠蛋白质的加工处理，通过减少新生蛋白质、降解未折叠蛋白及维持细胞内钙的平衡，从而促进细胞内环境稳态的恢复，保持细胞的正常功能和维持细胞存活。当ERS过强过久时可启动凋亡通路引发细胞功能异常，最终导致细胞死亡；当ERS能力低下时，有效的细胞保护机制减少，细胞对损伤性刺激因素的敏感性增加而导致或加速细胞的死亡[16-17]。

GRP78位于真核生物细胞的内质网膜上，与热休克蛋白70（Hsp70）家族具有高度同源性，被认为是Hsp70家族的成员之一。GRP78的表达变化被认为是ERS未折叠蛋白质反应的标志；在低糖、低氧、低Ca2+等应激反应调节时其基因的转录活性可提高10～25倍，表达量显著增高，从而维持了内质网钙稳态及内环境的稳定。因此，近年来认为细胞受刺激时GRP78呈高表达并合成GRP78的反应，可能是细胞的一种重要防御机制，该机制对细胞有保护作用从而延长在各种不利因素刺激下的细胞生存期[18-20]。然而，本研究通过Real-timePCR、Westernblot检测在NTM细胞及GTM细胞内GRP78mRNA及蛋白的表达，结果显示各组小梁网细胞均有GRP78表达，GRP78在GTM细胞内的表达水平较NTM细胞表达水平低。

Tm是细胞产生ERS的诱发因素。为了进一步证实GTM细胞内GRP78表达下调是由于细胞对ERS反应能力低下，本研究给予Tm药物处理，结果显示：NTM、GTM细胞经Tm处理后，GRP78mRNA及蛋白质表达量显著增加；GTM细胞GRP78表达水平的增加量明显低于NTM。该结果表明NTM及GTM细胞在ERS刺激下均能产生相应的应激反应，然而，后者对ERS刺激的反应能力明显低于前者。

STS以0.1μmol/L的浓度培养细胞6～24h，结果显示：NTM、GTM细胞内GRP78蛋白表达量均下调；GTM细胞GRP78表达下调明显大于NTM。以上结果提示，GTM细胞由于保护性GRP78蛋白下调，细胞内促生存因素下降，自身内质网防御功能被破坏，进而导致细胞对凋亡刺激敏感性增大。

目前的研究已经明确了GRP78的生物学特性和细胞保护作用，GRP78的表达多少对决定应激细胞的结局，如抵抗、适应、损伤或凋亡等有重要作用，所以这方面的研究无论在科学理论还是在应用前景上都具有重大意义。本实验结果显示，GTM细胞内GRP78表达下降且对ERS的反应低下，表明其防御体系被破坏，增加了细胞对损伤性刺激的敏感性，可能加速或导致小梁细胞的死亡，为POAG的后期干预治疗提供了有效靶点。

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生物细胞的定义范文

【关键词】血管内皮生长因子受体2

ConstructionandidentificationofsiRNAexpressionvectortargetingKDR

【Abstract】AIM:ToconstructpSilencerTM3.1H1smallinferferingRNA（siRNA）expressionvectortargetinghumanKDRgeneandtoobserveitssilencingeffectinthePC3prostatecancercellline.METHODS:ThedesignedoligostargetingKDRwereclonedintothepSilencerTM3.1H1neovector，whichwaslineatedafterBamHⅠandHindⅢdigestion.TherecombimantvectorswereconfirmedbyenzymedigestionanalysisandDNAsequencing.TherecombimantvectorsofpSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2andpSilencer3.1KDR3weretransfectedbyliposomemediatedtransfectionintothePC3prostatecancercelllinewithhighmetastasispotential.At72haftertransfection，theexpressionofKDRatthelevelsofmRNAandproteinwasdetectedbyRTPCRandWesternblotting.RESULTS:ThepSilencerTM3.1H1siRNAexpressionvectorswereconstructedandconfirmedaftertheenzymedigestionanalysisandtheDNAsequencing.ThesiRNAexpressionvectorsofpSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2andpSilencer3.1KDR3，weresuccessfullyconstructed.pSilencer3.1KDR3wasmosteffectiveinthe3whichdownregulated55%mRNAandproteinofKDRat72haftertransfection.CONCLUSION:pSilencerTM3.1H1siRNAexpressionvectorstargetingKDRweresuccessfullyconstructed.TheexpressionofKDRgenewasinhibitedeffectivelyinPC3cellstransfactedbypSilencer3.1KDR3，whichlaidabasisforitsapplicationinthetreatmentofprostatecancer.

【Keywords】vascularendothelialgrowthfactorreceptor2;RNA，smallinterfering;PC3cellline

【摘要】目的：构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(VEGFR2)，又称激酶功能区受体（KDR）的pSilencerTM3.1siRNA(smallinterferingRNA)表达载体，并在前列腺癌细胞PC3中观察其干扰效果.方法：设计针对KDR基因编码区的寡核苷酸链，体外退火后克隆入经BamHⅠ，HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1H1neo中，对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定.以脂质体法将pSilencerTM3.1H1neo空载体和3个(pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3)重组质粒分别导人PC3前列腺癌细胞系.72h后用RTPCR和Westernblotting技术检测各实验组前列腺癌细胞内KDRmRNA及蛋白水平的表达情况.结果：经酶切鉴定及DNA测序，重组质粒中已插入了目的基因片断.转染KDRsiRNA的前列腺癌细胞，72h后，而以pSilencer3.1KDR3的抑制KDRmRNA及蛋白表达效果最为有效，其抑制率约为55%.结论：成功构建了针对KDR的RNA干扰表达载体pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3，pSilencer3.1KDR3能有效抑制KDR在前列腺癌细胞中表达，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.

【关键词】血管内皮生长因子受体2；RNA，小分子干扰；PC3细胞系

0引言

血管内皮生长因子受体Ⅱ(vascularendothelialgrowthfactorreceptorⅡ，VEGFR2)，又称激酶功能区受体（kinasedomainreceptor，KDR)，在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达，对于VEGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用.研究表明，人前列腺癌细胞中有VEGF和KDR表达，存在VEGFKDR自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关［1-2］.RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默的过程，它作为新兴的基因阻断技术，目前已广泛应用于基因功能及基因治疗的相关研究.我们通过构建KDR基因特异性smallinterferingRNA(siRNA)表达载体，检测其对前列腺癌细胞系PC3中KDR基因的沉默作用，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.

1材料和方法

1.1材料pSilencerTM3.1H1neo质粒购自美国Ambion公司；KDR特异性DNA片断由北京赛百胜公司合成；BamHⅠ，HindⅢ限制性内切酶，T4DNA连接酶，DNA酶Ⅰ，Taq酶购自大连宝生物公司；去内毒素质粒提取和反转录试剂盒购自美国Promega公司；RPMI1640培养基、RNA提取、Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；PC3细胞株，DH5a菌种为本室保存；小鼠抗人KDR单克隆抗体购自R&D公司；免疫印记所用二抗（羊抗鼠）、DAB显色液均购自武汉博士德公司；GAPDH内参及其抗GAPDH单抗均购自上海康成生物有限公司；Mini2Dcell型电转印仪为BioRAD公司生产；DU800核酸蛋白分析仪为贝克曼公司产品；FR200图像分析系统为上海复日科技公司产品；pEGFPN2质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠.

1.2方法

1.2.1siRNA靶序列的设计根据shRNA设计原则［3］及KDR(基因号AF063658)cDNA序列，使用美国Ambion公司在线设计软件设计针对KDR基因编码区（A：395414；B：29692988；C：39063925）特异性插入片断序列共三对六条，分别命名为（pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2，pSilencer3.1KDR3）.pSilencer3.1KDR1：正义链为5′GATCCGCATGGAGTCGTGTACATTATTCAAGAGATAATGTACACGACTCCATGTTTTTTGGAAA3′；反义链为5′AGCTTTTCCAAAAAACATGGAGTCGTGTACATTATCTCTTGAATAATGTACACGACTCCATGCG3′；pSilencer3.1KDR2：正义链为5′GATCCGCTCCTGAAGATCTGTATATTCAAGAGATATACAGATCTTCAGGAGCTTTTTTGGAAA3′；反义链为5′AGCTTTTCCAAAAAAGCTCCTGAAGATCTGTATATCTCTTGAATATACAGATCTTCAGGAGCG3′；pSilencer3.1KDR3：正义链为5′GATCCGCGGCTACCAGTCCGGATATTCAAGAGATATCCGGACTGGTAGCCGCTTTTTTGGAAA3′；反义链为5′AGCTTTTCCAAAAAAGCGGCTACCAGTCCGGATATCTCTTGAATATCCGGACTGGTAGCCGCG3′.黑体部分为KDR基因特异性序列，序列经同源性分析后，提交公司合成.

1.2.2KDRsiRNA表达载体的构建合成编码发夹结构siRNA的正义链和反义链，分别取5μL正反义寡核苷酸(终浓度均为25mol/L)，10μL5×退火缓冲液(500mmol/LNaCl，50mmol/LTris，pH7.6)，加入30μL去离子水于95℃水浴中5min，然后自然冷却至室温.将退火后的双链siRNA模板与载体于16℃连接过夜，以连接产物转化E.coliDH5a感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载体.扩增白色的抗性菌落并提取质粒，以BamHⅠ，HindⅢ双酶切鉴定重组质粒.收集酶切鉴定正确的重组质粒，提交大连宝生物公司进行DNA序列测定.

1.2.3转染用质粒DNA的制备、纯化及定量以去内毒素质粒提取试剂盒，分别提取pSilencerTM3.1H1neo空载体和KDRsiRNA重组质粒.经分光光度计和电泳检测，A260nm/A280nm>1.8，且无任何降解的DNA用于转染.

1.2.4KDRsiRNA质粒的细胞转染用去内毒素质粒提取试剂盒提取测序正确的各重组质粒和pEGFPN2质粒.将PC3细胞按1×105/孔的数量转种于6孔培养板，RPMI1640培养液（含100mL/L小牛血清，100万U/L青霉素，100万U/L链霉素），37℃，5mL/LCO2培养至80%左右，更换无抗生素、无血清的RPMI1640培养液继续培养6h，分别用各重组质粒转染PC3细胞，使用美国Ambion公司提供的含有与任何已知序列不同源的shRNA序列的质粒为阴性对照和未转染照.每孔质粒用量为2μg，脂质体用量为5μL.以pEGFPN2质粒同步转染检测转染效率.转染后6h更换为含200mL/L小牛血清无抗生素RPMI1640培养液.瞬时转染后72h收获细胞检测KDR的表达水平.

1.2.5KDRsiRNA转染细胞KDRmRNA表达的RTPCR检测转染后72h，提取总RNA并定量，用DNA酶Ⅰ处理总RNA以去除DNA污染，各实验组取同等量的RNA反转录后进行PCR.pSilencer3.1KDR1位点PCR引物正义链：5′GCCCAATAATCAGAGTGGCAGTG3′，反义链：5′GAGACGGACTCAGAACCACATCA3′，产物长度506bp；pSilencer3.1KDR2位点PCR引物正义链：5′GCACGATTCCGTCAAGGG3′，反义链：5′TTCAAAGGGAGGCGAGCA3′，产物长度383bp；pSilencer3.1KDR3位点PCR引物正义链：5′ACGGACAGTGGTATGGTT3′，反义链：5′CGAGTCAGGCTGGAGAAT3′，产物长度279bp.内参照βactin，PCR引物正义链：5′GCTCGTCGTCGACAACGGCTC3′，反义链：5′CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC3′，产物长度353bp.PCR产物经琼脂糖电泳后于FR200图像分析系统分析.

1.2.6KDRsiRNA转染细胞KDR蛋白表达的Westernblotting检测转染后72h，提取细胞总蛋白并定量，调整蛋白浓度至相同水平进行SDSPAGE电泳，电泳完毕后，marker的条带进行考马斯亮兰染色，余下的胶按操作说明装入电转印仪，100V电转45min后加50g/L脱脂奶粉封闭；加1/1000PBS稀释的KDR抗体，4℃孵育过夜；PBSTween洗涤，加1/1000稀释的二抗室温60min；PBSTween洗涤后DAB显色30min，于FR200图像分析系统分析结果.

2结果

2.1KDRsiRNA片段的获得合成的KDRsiRNA寡核苷酸片段退火后得到约66bp的DNA片段，提示退火成功.

2.2pSilencerTM3.1/KDRsiRNA重组质粒的构建及鉴定酶切后的琼脂糖电泳图可见一大小为66bp左右的酶切片断，与设计合成的KDR基因特异性序列大小相符（图1）.将各重组质粒分别命名为pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2，pSilencer3.1KDR3，阴性对照质粒命名为pSilencer3.1NC(negativecontrol).DNA序列测定结果表明，各序列已成功插入了pSilencerTM3.1H1neo载体（图2）.

M:DNAmarker；1：pSilencer3.1KDR1；2：pSilencer3.1KDR2；3：pSilencer3.1KDR3；4：pSilencer3.1H1neo.

图1重组pSilencerTM3.1/KDRsiRNA表达载体的双酶切鉴定（略）

2.3转染效率的观察转染后24h，经荧光倒置显微镜下观察pEGFPN2质粒同步转染的PC3，结果显示，此次转染的效率约为60%~70%.

2.4KDRsiRNA转染细胞的RTPCR鉴定将构建好的KDR的RNAi载体pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3以及pSilencer3.1NC以脂质体分别转入PC3前列腺癌细胞，提取各组细胞总RNA经RTPCR扩增KDR片段，琼脂糖凝胶电泳结果(图3)显示，pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2重组质粒转染的PC3细胞KDR的mRNA水平变化不明显，pSilencer3.1KDR3重组质粒转染的PC3细胞的KDRmRNA水平较亲本细胞和阴性质粒转染细胞明显下调，抑制率约为55%.

A:pSilencer3.1KDR1；B：pSilencer3.1KDR2；C：pSilencer3.1KDR3.

图2重组pSilencerTM3.1/KDRsiRNA表达载体插入片断的测序结果（略）

M:DNAmarker；A1：pSilencer3.1KDR1；A2：pSilencer3.1NC；A3：PC3；A4~A6：βactin;B1：pSilencer3.1KDR2；B2：pSilencer3.1NC；B3：PC3；B4~B6：βactin;C1：pSilencer3.1KDR3；C2：pSilencer3.1NC；C3：PC3；C4~C6：βactin.

图3KDR表达的RTPCR鉴定2.5KDRsiRNA转染细胞的Westernblotting鉴定提取PC3，pSilencer3.1NC，pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3（略）

各组细胞总蛋白，行Westernblotting检测，鉴定结果见图4.由图4可见，亲本细胞、阴性质粒转染细胞pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2重组质粒转染的PC3细胞KDR的蛋白总量水平无明显差别，pSilencer3.1KDR3重组质粒转染的PC3细胞，KDR蛋白总量明显下调，抑制率约为55%.

1:pSilencer3.1KDR1;2:pSilencer3.1KDR2;3:pSilencer3.1KDR3;4:pSilencer3.1NC;5:PC3.

图4KDR表达的Westernblotting鉴定（略）

3讨论

血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)及其受体在肿瘤血管形成中起着关键的调节作用［4-5］，能刺激血管内皮细胞分裂、增殖，诱导血管生成，有助于肿瘤的生长和转移.VEGFR家族的成员包括：VEGFR1（Flt1），VEGFR2（KDR/Flk1），VEGFR3（Flt4）.KDR是发挥功能的主要受体，它不仅表达于肿瘤组织的血管内皮细胞，而且表达于肿瘤细胞的胞膜和/或胞质，提示肿瘤细胞分泌的VEGF不仅以旁分泌方式作用于血管内皮细胞并诱导血管新生，也可通过自分泌途径与自身表面的受体结合而促进细胞生长或迁移，从而抑制细胞凋亡.研究表明阻断VEGF与KDR的相互作用能抑制动物体内实体瘤的生长，达到治疗肿瘤、抑制肿瘤生长的目的.Witte等［6］制备的可与KDR特异性结合的单抗DC101，在体外能抑制VEGF与受体的结合，阻断VEGF诱导的信号传导.Bruns等［7］用DC101治疗前列腺转移直肠癌小鼠模型，发现该治疗不仅抑制小鼠肿瘤血管的生成，而且导致肿瘤内皮细胞的死亡.这些结果表明抑制肿瘤细胞和/或肿瘤血管内皮细胞上VEGF受体的表达，不仅可阻止肿瘤细胞的生长，也可抑制肿瘤血管的生成，从而阻断肿瘤的生长和转移.

RNAi技术是指一短双链RNA(21bp)可使具有同源结构的RNA降解，它是近年来新发现的一个强大的基因研究工具.将具有反向重复序列的DNA模板克隆至RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)转录单位中，以质粒DNA为载体转染哺乳动物细胞，利用细胞中RNA聚合酶持续转录合成RNA，这种RNA内部互补折叠形成短发卡样dsRNA，被RNA酶样物质(Dicer)切割形成21或23个碱基的双链RNA，即siRNA.由于类似于天然的siRNA，同反义核酸技术和单链RNA相比，siRNA更有效，可在更长的时间内抑制靶基因的表达［8］.

人前列腺癌组织中有VEGF和KDR表达，且VEGF和KDR表达与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关.我们成功构建了3个针对KDR基因的重组转录载体pSilencer3.1KDR1，pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3.转染KDRsiRNA的PC3前列腺癌细胞，72h后KDRmRNA及蛋白表达下调，而以pSilencer3.1KDR3的抑制效果最为明显，抑制率约为55%.构建的RNA干扰表达载体能明显干扰KDRmRNA及蛋白的表达，为进一步研究KDR的功能以及应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.

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生物细胞的定义范文篇11

目的:构建用于rnai的shrna（smallhairpinrna）表达载体及检测其对低氧诱导因子1（hypoxiainduciblefactor1,hif1）基因的沉默效果。方法:从人血基因组中pcr扩增出h1基因启动子,克隆入酶切处理后的pegfpc1载体片段中,此载体命名为pwh1。以人hif1cdna基因为靶标设计引物,退火后克隆入pwh1。新的载体转染sgc7901细胞,然后用rtpcr和westernblot检测hif1基因的表达改变。结果:构建的pwh1载体能很好地表达针对hif1基因的shrna,rtpcr和westernblot的结果显示hif1基因的mrna和蛋白表达水平均明显下降。结论:成功构建了shrna表达载体pwh1,这对于基因的功能研究具有重要的意义。

【关键词】shrna表达载体rna干涉hif1基因

[abstract]aim:toconstructtheexpressionvectorofsmallhairpinrna（shrna）andtotestitsefficacyinsilencingthehypoxiainduciblefactor1(hif1)gene.methods:theh1genepromoterwasamplifiedfromthegenomeofthehumanbloodcellsbypcr.thenthepromoterwasclonedintothepegfpc1vectordigestedwiththerestrictionenzyme.theconstructedvectorwasnamedpwh1.theprimerwasdesignedtotargetthehumanhif1cdnagene.theannealedprimerfragmentwasclonedintopwh1.thenewconstructedplasmidwastransfectedintothesgc7901cellline.thentheexpressionlevelofhif1genewasassayedbyrtpcrandwesternblot.results:thenewlyconstructedplasmidexpressedshrnatotargetthehif1gene.theresultsofrtpcrandwesternblotshowedtheexpressionofhif1genewasreduceddramaticalyinmrnaandatproteinlevel.conclusion:thesuccessfulconstructionofshrnaexpressionvector(pwh1)providesatoolforfurtherresearchintothefunctionofanovelgene.

[keywords]shrna;expressionvector;rnainterference;hif1gene

rna干涉(rnainterference,rnai)是将双链rna（dsrna）导入细胞引起特异基因mrna降解的一种细胞反应过程。它是转录后基因沉寂（ptgs）的一种。1998年,fire等[1]在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现,由正义和反义rna退火形成的dsrna引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义rna强10倍以上。dsrna引起的基因表达抑制不是正义或反义rna引起的基因表达抑制在数学上的叠加,这就说明dsrna触发了细胞内的一些反应机制,从而引起了高效和特异的基因表达抑制效果。当时,他们就把这种现象命名为rnai。rnai的应用谱非常广泛,从单细胞生物一直到人。其中研究最多的就是线虫,其次就是果蝇。哺乳动物细胞的rnai应用研究并不象无脊椎动物那样进展得那么顺利。wianny等[2]将dsrna用显微注射的方法在小鼠胚胎成功进行了rnai。sayda等[3]用人工合成的21ntrna二合体在培养的哺乳动物细胞成功进行了rnai。brummelkamp等[4]利用载体表达的shrna在许多培养的人源,猴源和鼠源的哺乳动物细胞的rnai实验中取得了成功。

在真核细胞内,rna聚合酶iii能指导短rna的表达和rna聚合酶iii结合的启动子有h1,u6等。目前,这两种启动子都被尝试作为表达短rna的工具。本实验旨在克隆得到的h1启动子的基础上构建一个能稳定表达shrna的真核载体。然后针对hif1基因mrna设计靶标,在培养的sgc7901细胞（胃癌细胞系）内进行rnai实验,以观察新建的pwh1载体在基因沉默中的使用效率。这将为以后新基因的功能研究和基因治疗奠定基础。

1材料和方法

1.1材料pegfpc1质粒为clontech公司产品;各种限制性内切酶为neb公司产品。t4连接酶、pfudna聚合酶和dl2000dnamarker为takara公司产品。各种引物均由北京赛百盛公司合成。sgc7901细胞由全军消化病研究所保存。superscriptii反转录试剂盒购自invitrogen公司;兔抗人hif1多抗、兔抗人βactin多抗和westernblotluminolreagent为santacruz公司产品。top10菌种由本实验室保存。

1.2方法

1.2.1以pegfpc1为框架构建shrna表达载体pwh1(1)用asei和mlui双酶切,去掉pegfpc1质粒上pcmv,egfp,mcs和sv40polya等片段,剩余的部分作为构建pwh1的框架。在asei和mlui之间加上一个接头dna序列,该段接头dna由下面2条引物退火形成（退火温度:39.5℃）:序列1:5′taatggaattcgaagctta3′;序列2:5′cgcgtaagcttcgaattccat3′。(2)通过pcr从人血细胞基因组dna获得h1rna基因promoter[5]。取新鲜血液20ml,以1300r/min离心15min,取淡黄层细胞（白细胞）重悬于15ml抽提缓冲液（10mmol/ltrisclph8.0,0.1mmol/ledtaph8.0,20mg/l胰rna酶,5g/lsds）,37℃温育1h。加蛋白酶k至终浓度为100mg/l,温和混匀。50℃水浴中放置3h。冷却至室温后,用等体积酚和氯仿抽提后,加入0.2体积10mol/l乙酸铵和2体积的乙醇,放置30min,12000r/min离心10min。700ml/l乙醇洗涤2次,空气中晾干。加入1mlte(ph8.0)溶解dna,此即人血细胞基因组dna。以此dna为模板,pcr引物为:p1:5′ccatggaattcgaacgctgacgtc3′(含ecori位点);p2:5′gcaagcttagatctgtggtctcatacagaacttataagattccc3′(含hindiii,bglii位点)。pcr产物通过ecori和hindiii两个酶切位点克隆入puc19质粒,进行序列验证。(3)pwh1载体的构建:pcr产物用ecori和hindiii双酶切,克隆入同样用这两种酶双酶切的上述框架载体。新载体命名为pwh1。

1.2.2用pwh1进行沉默hif1基因的表达(1)以人hif1cdna基因为靶标的引物设计:选取人hif1cdna基因(genbank登录号:af304431)中的512～530核苷酸为靶标,设计两条引物。序列如下:引物1:5′gatcccctgaagtgtaccctaactagttcaagagactagttagggtacacttcatttttggaaa3′;引物2:5′agcttttccaaaaatgaagtgtaccctaactagtctcttgaactagttagggtacacttcaggg3′。(2)构建针对hif1基因的shrna表达载体pwh1hif1。将上面合成的两条引物用te（ph8.0）稀释成0.5nmol/μl。各取5μl混匀,沸水中放置10min,缓慢冷却至室温4℃-20℃保存备用。用限制性内切酶bglii和hindiii对质粒pwh1做双酶切。用t4连接酶对pwh1质粒和退火产物进行连接。将连接产物转化大肠杆菌dh2α感受态细胞。铺于含卡那霉素的lb平板上,37℃培养24h。挑取单克隆并提取质粒。用限制性内切酶ecori和hindiii对候选阳性克隆质粒做双酶切鉴定。阳性克隆质粒命名为pwh1hif1。（3）转染胃癌细胞系sgc7901:sgc7901细胞用rpmi1640培养液（含100ml/l小牛血清）在37℃、50ml/lco2条件下培养。转染前24h将处于对数生长期的细胞重新接种于6孔板（瞬时）和24（稳定）孔板中,贴壁细胞在长满底面积80%时进行转染。转染按照lipofectaminetm2000试剂说明书操作。于转染后48h收集6孔板内细胞,做为瞬时转染细胞表型鉴定用。于转染后72h按1∶10比例传代于60mm直径培养皿中,然后加入适量(400～1000mg/l)g418进行筛选,2周后挑取单个细胞集落,扩大培养,然后做为稳定转染细胞表型鉴定用。(4)rtpcr检测hif1基因的mrna水平:待6孔板内细胞生长至底面积90%～95%时,收集细胞。参照gibco公司trizol试剂使用方法提取细胞rna,溶于20μldepc水内。用superscripttmiirtkit参照其使用说明进行cdna第1条链的合成。人βactin内对照引物:p1:5′ggccgggacctgactgactac;p2:5′tctttgcggatgtccacgtc（长度331bp）。人hif1rtpcr引物:p3:gatctcggcgaagtaaagaatctg;p4:agaaaatttcatatccaggctgt（长度680bp）。pcr反应条件:95℃1min(94℃40s;56℃40s;72℃40s)×26cycle;72℃10min;4℃保存。(5)westernblot检测hif1的蛋白水平:已处理的转染细胞样品经sds聚丙烯酰胺凝胶电泳后,100伏转移3h至nc膜上,50g/l脱脂奶粉室温封闭2h,依次加入1∶2500稀释的兔抗人一抗4℃孵育过夜,1∶5000稀释的hrp标记的鼠抗兔二抗作用2h,加入luminol试剂,并以x光片捕捉hrp催化luminol试剂所产生的激发光。

2结果

2.1shrna表达载体pwh1构建的实验结果

2.1.1从人血细胞基因组dna中扩增得到h1rna基因promoterpcr反应体系:dna模板2μl,p11μl,p21μl,taq0.5μl,dntp2μl,10×buffer5μl,h2o38.5μl,总体积50μl。pcr反应条件为:94℃5min(94℃30s;45℃45s;72℃30s)×5cycle;(94℃30s;56℃45s;72℃30s)×25cycle;72℃2min;4℃保存。10g/l琼脂糖凝胶电泳后,在250bp左右可以见到一扩增条带(图1),大小与理论预计一致。

图1h1基因启动子的pcr扩增电泳结果（略）

fig1ageanalysisofpcrproductsencodingh1genepromoter

m:dnamarkerdl2000;1:pcrofh1genepromoter.

2.1.2重组质粒puc19h1的酶切鉴定上述pcr产物经ecori和hindiii双酶切后,克隆入puc19载体。阳性克隆命名为puc19h1（图2）。puc19h1质粒递交上海生工公司测序,结果显示,与genbank的h1基因启动子序列（登录号:x16612）完全一致。

图2重组质粒puc19h1的酶切鉴定结果（略）

fig2ageanalysisofrecombinantplasmidpuc19h1digestedwithecoriandhindiii

m:dnamarkerdl2000;1,2:puc19h1.

2.1.3pwh1双酶切鉴定pegfpc1质粒经asei和mlui双酶切后,加上一段由2条引物退火形成的接头dna,此框架质粒命名为pwk。再利用接头上带有的ecori和hindiii酶切位点将puc19h1质粒上的目的片段亚克隆到这个框架质粒上。新的质粒命名为pwh1(图3)。

图3pwh1质粒的酶切鉴定结果（略）

fig3ageanalysisofplasmidpwh1digestedwithecoriandhindiii

m:dnamarkerdl2000;1:pwk;2:pwh1.

2.2pwh1hif1的酶切鉴定结果将合成的2条引物退火后,从bglii和hindiii两个酶切位点克隆到质粒pwh1。新的质粒命名为pwh1hif1。用ecori和hindiii对pwh1hif1进行双酶切鉴定（图4）,阳性克隆切下约310bp片段,阴性克隆切下约250bp片段。

图4pwh1hif1质粒的酶切鉴定（略）

fig4ageanalysisofrecombinantplasmidpwh1hif1digestedwithecoriandhindiii

m:dnamarkerdl2000;1:pwh1hif1;2:pwh1.

2.3pwh1hif1瞬时转染sgc7901细胞将准备好的pwh1hif1质粒5μg用脂质体方法转染入sgc7901细胞,48h后收集细胞。用trizol试剂抽提细胞rna,进行rtpcr。12g/l琼脂糖凝胶电泳结果（图5）可以看出,rnai后和对照组相比mrna被明显降解。

图5pwh1hif1瞬时转染sgc7901细胞后的rtpcr结果（略）

fig5rtpcrresultofsgc7901cellstransienttransfectedwithpwh1hif1

m:dnamarker;1:sgc7901;2:sgc7901transfectedwithpwh1;3:sgc7901transfectedwithpwh1hif1.

2.4pwh1hif1稳定转染sgc7901细胞将准备好的pwh1hif1质粒2μg用脂质体方法转染入sgc7901细胞,按有限稀释法挑取单克隆细胞。用trizol试剂抽提细胞rna,进行rtpcr。12g/l琼脂糖凝胶电泳结果（图6）可以看出,rnai后和对照组相比mrna被明显降解。

图6pwh1hif1稳定转染sgc7901细胞后的rtpcr结果（略）

fig6rtpcrresultofsgc7901cellsstabletransfectedwithpwh1hif1

m:dnamarker;1:sgc7901transfectedwithpwh1hif1;2:sgc7901transfectedwithpwh1;3:sgc7901.

2.5westernblot检测hif1基因的rna干涉效果挑取3个稳定转染pwh1hif1质粒的sgc7901单克隆细胞。用抗hif1抗体进行westernblot和化学发光显色（图7）可见,rnai后和对照组相比hif1的蛋白表达水平明显下降。

图7pwh1hif1稳定转染sgc7901细胞后的westernblot结果（略）

fig7westernblotresultofsgc7901cellsstabletransfectedwithpwh1hif1

1-3:3sgc7901cellclonestransfectedstablywithpwh1hif1;pwh1:sgc7901cellclonetransfectedstablywithpwh1.

3讨论

rnai一经发现,立即成为科学研究的一大热点。这是因为rnai这个生物领域的新兴事物,本身具有它的神秘性,同时又具有广阔的应用前景[6]。rnai已经被应用到线虫的系统性功能基因组研究上,rnai作为一个工具,它的应用范围可以从单细胞的原生动物一直扩展到人。使哺乳动物细胞产生特定基因的功能丧失表型,对于新基因功能研究、新蛋白质药物的开发和基因治疗等方面都具有重要的意义。本实验构建的pwh1载体,能在真核细胞内表达shrna,shrna可以有效模仿sirna,使目标蛋白的mrna发生特异性的降解。pwh1可被广泛用于真核细胞的rnai实验模型。

缺氧诱导因子1(hif1)是机体细胞在低氧环境中产生的一种结合dna蛋白质因子,在低氧信号中起到一个重要的中介作用,通过转录水平参与对低氧反应基因的调控,从而使机体对低氧刺激作出复杂的病理生理反应［7］。hif1在多种肿瘤中广泛存在,它与一系列缺氧反应靶基因上的特定结合位点缺氧反应元件(hypoxiaresponseelement,hre)结合,从而启动靶基因的转录表达,同肿瘤的增殖、转移密切相关［8］。talks等[9]发现大多数恶性肿瘤细胞中有hif1表达,且hif1在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘表达明显增多。本实验在胃癌细胞系sgc7901中利用所构建的pwh1载体成功降低了hif1基因的表达,这对研究胃癌的发生、增殖、多药耐药和治疗等均有重要的意义。

【参考文献】

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生物细胞的定义范文篇12

rnai指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链rna(double?strandedrna,dsrna)启动并介导与其同源mrna的特异性降解，从而抑制相应基因表达的过程[1]。在rnai过程中，细胞内小干扰rna(smallinterferingrna,sirna)的来源有不同的形式，以sirna表达载体(质粒或病毒载体)法的应用最为广泛。本研究以真核表达质粒pmu6为基础，针对bi?1基因的5个不同位点设计并构建shrna表达质粒，以期在肿瘤细胞内表达sirna，并观察bi?1shrna表达质粒在两种肿瘤细胞内介导的rnai效应对靶细胞生长增殖的影响。

1材料和方法

1.1菌株、细胞株与质粒

大肠杆菌dh2α自卫生部武汉生物制品研究所引进；鼻咽癌低分化上皮细胞株cne?2z、鼻咽癌高分化上皮细胞株cne?1、高转移卵巢浆液性囊腺癌细胞株ho8910pm细胞株、卵巢浆液性囊腺癌细胞株ho8910自上海细胞生物所引进；pmu6质粒由本课题组构建并保存[2]。

1.2试剂与仪器

rpmi?1640培养基和小牛血清购于美国gibco公司；脂质体(lipofectminetm2000)购于invitrogen公司；质粒dna小量提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；工具酶购于新英格兰生物公司(neb)和华美生物工程公司；四氮唑蓝(mtt)购于sino?americanbiotechnology公司；酶标仪为美国bio?rad公司产品；其他试剂均为进口或国产分析纯产品。

1.3表达bi?1shrna载体的构建及鉴定

根据reynolds等[3]的原则进行sirna序列的设计，从人bi?1基因(gi:23271944)序列中选择position:212～238、position:350～376、position:573～599、position:735～761四个位点(因bi?1的cds为141～854)，分别命名为bi?1?1、bi?1?2、bi?1?3、bi?1?4，相应的重组质粒命名为pmu6?bi?1?1、pmu6?bi?1?2、pmu6?bi?1?3、pmu6?bi?1?4；同时设计一个阴性对照sirna序列，命名为bi?1?s，相应的重组质粒命名pmu6?bi?1?s。候选bi?1sirna序列需要经过genbank数据库的blast分析。sirna序列只列出正链序列：bi?1?1(27nt)正义链：5′?gcagcacctgaagaaggtctatgcaag?3′；bi?1?2(27nt)正义链：5′?gctgatggcaacacctcatagccatga?3′；bi?1?3(27nt)正义链：5′?ggtatcttgatgtcagccctgagcttg?3′；bi?1?4(27nt)正义链：5′?ggagatcaagattatatctggcactgc?3′；bi?1?s(27nt)正义链：5′?ggtatcttgatgtgccacctgagcttg?3′。表达shrna的转录模板是由9bp的连接片段将sirna序列的正义链(27nt)和反义链(27nt)连接而成的反向重复序列，5对shrna转录模板序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

将各shrna转录模板退火后，与bbsⅰ酶切后的pmu6大片段进行定向重组，然后转化，筛选阳性克隆。小量提取阳性克隆菌质粒dna后直接进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定；另各取1μg质粒dna进行pcr扩增，pmu6上游引物：5′?cgacacggaaatgttgaa?3′；pmu6下游引物：5′?agggaagaaagcgaaagga?3′。pcr扩增参数为94℃3min，94℃40s、52℃90s、72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸7min。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr扩增产物，将经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定正确的阳性克隆菌进行测序鉴定。

1.4细胞培养及转染

将cne?2z、cne?1、ho8910pm、ho8910细胞株常规传代培养于rpmi?1640培养液中，取对数生长期细胞用于实验，按照转染试剂操作手册进行转染实验[4]。

1.5mtt比色法检测细胞的生长抑制率

实验设未处理组、lip(脂质体)组、pmu6质粒对照组、各重组干扰质粒组。各组的质粒浓度为2mg/l(0.2μg/孔)；lip组按转染相应浓度质粒所需用量设计其终浓度。转染48h后，每孔加入10g/lmtt10μl，培养4h后，加二甲基亚砜100μl，测定波长570nm和630nm处的吸光度a值。每组设4个平行孔，结果取平均值，重复3次实验。按以下公式计算细胞生长抑制率：抑制率(%)=(1－实验孔a值/对照孔a值)×100%。

1.6统计学方法

实验数据以±s表示，采用spss13.0forwindows统计软件，进行单因素方差分析和差异显著性检验。p>0.05为差异无统计学意义，p<0.05为差异有统计学意义，p<0.01为差异有显著统计学意义。

2结果

2.1表达bi?1shrna重组质粒的鉴定

将提取的质粒进行1%普通琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。电泳结果与理论值(质粒pmu6为4856bp，质粒pmu6?bi?1?1、pmu6?bi?1?2、pmu6?bi?1?3、pmu6?bi?1?4和pmu6?bi?1?s均为4614bp)相符。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr扩增产物，结果见图2。各重组质粒的pcr扩增产物为752bp，而质粒pmu6的pcr扩增产物为994bp，电泳结果与理论值相符。

2.2各重组质粒表达的bi?1shrna对cne?2z、cne?1、ho8910pm、ho8910细胞生长增殖的影响

为了观察针对bi?1设计的sirna序列对cne?2z、cne?1、ho8910pm、ho8910细胞株的抑制效率，我们用上述重组质粒对cne?2z、cne?1、ho8910pm、ho8910细胞株进行转染实验，mtt结果见表1～4。表1脂质体介导的重组质粒对cne?2z细胞生长抑制作用

3讨论

rnai是由dsrna介导的同源mrna特异性降解现象。目前rnai作为一种新的反向遗传学手段引起了人们的广泛关注，自2001年tuschl首先成功地将rnai技术用于哺乳动物细胞起[5]，rnai不但被应用于哺乳动物细胞的基因功能分析，还被广泛用于肿瘤的基因治疗。

本文所选择的靶基因bi?1是近年发现的一种凋亡抑制因子，不属于与程序性细胞死亡(programmedcelldeath,pcd)有关的任何基因家族，是少数几种同时存在于动物和植物中的保守性细胞死亡抑制因子之一；在动物中，bi?1是受bcl?2和bax调控的细胞死亡通路上的新型调节因子。与相应的正常细胞相比，bi?1在前列腺癌[6]、原发性乳腺癌[7,8]细胞中的表达上调4倍到10倍；另外，在子宫癌、卵巢癌和肺腺癌细胞[9]中也发现bi?1基因表达的上调，这些表明，bi?1基因的过表达可能与多种肿瘤的发生发展密切相关。运用rnai技术阻抑bi?1基因在人前列腺癌、原发性乳腺癌中的表达,已获得了诱导肿瘤细胞凋亡的满意结果，故bi?1有望成为这些肿瘤潜在的预后标志。文献报道[8]，bi?1在某些肿瘤细胞中的表达不依赖于肿瘤细胞的分化程度。据已检索到的文献，迄今国内尚无通过阻抑bi?1基因表达诱导肿瘤细胞凋亡的相关研究报道，故本研究选择具有不同分化程度的鼻咽癌细胞和具有不同转移潜能的卵巢癌细胞进行初步的研究。

本研究构建的质粒载体可在细胞内表达针对bi?1的shrna，shrna在细胞内酶的作用下可迅速形成sirna[10]，故可观察它们在不同肿瘤细胞内产生的rnai效应对细胞生长增殖的影响。在mu6启动子作用下，重组质粒所表达的shrna如图3(只列出pmu6?bi?1?1重组质粒表达的shrna，其他类似)。

本课题组经实验证实cne?2z和cne?1细胞中均有bi?1基因的表达且表达量的差异无统计学意义。把表达bi?1shrna的质粒转染至cne?2z、cne?1细胞中，发现针对bi?1的不同sirna序列对cne?2z、cne?1细胞生长增殖均有较强的抑制作用。统计学分析表明，通过阻抑bi?1基因表达对鼻咽癌细胞生长增殖的影响并不依赖于鼻咽癌细胞的分化程度，故初步推测：利用rnai技术阻抑bi?1基因表达抑制鼻咽癌细胞生长增殖进而诱导鼻咽癌细胞凋亡的过程中，cne?2z和cne?1细胞发生凋亡的机制可能是相同或相似的，具体的机制有待于进一步的研究。

本课题组经实验证实ho8910pm和ho8910细胞中也有bi?1基因的表达且表达量的差异无统计学意义。当转染表达bi?1shrna的干扰质粒至ho8910pm和ho8910细胞中时，发现它们对ho8910pm的生长增殖均有较强抑制作用，而对ho8910细胞的生长增殖无明显抑制作用。肿瘤细胞的生长、增殖、分裂与细胞周期的调控密切相关，一些基因及其产物如p53、p21、cyclind1、pcna等是细胞周期调控中重要的调控因子[11]。由于ho8910pm和ho8910细胞在癌基因和抑癌基因、转移基因和抑转移基因、凋亡基因和存活基因等的表达上存在差异[12]：ho8910pm细胞中，p21、cyclind1、cd44v6、凋亡连接基因2(alg?2)[13]、突变型p53、egfr等的表达强度大于ho8910细胞；ho8910pm细胞中，nm23、p16的表达强度弱于ho8910细胞，所以，这两株细胞在生长、增殖等过程中具有各自的生物学特征。肿瘤的发生和发展是一个多基因参与，经过多阶段协同作用的结果，某一基因的变化仅仅影响肿瘤一定阶段的某些生物学特征。本文通过阻抑bi?1一个基因表达，观察到对ho8910pm和ho8910细胞生长增殖影响的差异，可能与这两株具有不同转移潜能的卵巢癌细胞中蛋白表达存在明显差异有关，具体机制还有待进一步地研究与探讨。

【参考文献】

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