[关键词]植物细胞工程育种
中图分类号：S682.11文献标识码：A文章编号：1009-914X（2016）21-0129-01
对于植物细胞工程研究来讲主要研究的内容包含植物细胞的培养以及植物细胞之间的融合与变异等，利用植物细胞工程可以改善植物自身的品种以及生产成长等过程，是一种非常高端的技术。植物细胞主要产生于现代生物科学与工程学的基础上，同时需要的理论主要是根据植物体内细胞变化性能为主。植物细胞工程主要研究对象是对植物中的育种等方面进行详细分析与掌握，根据相关的细胞变化对其进行创新与改造，将多种植物细胞育种技术相互结合，研发新的植物品种。
一、植物细胞工程概述
在植物自身中含有很多的细胞，其中具有很多遗传因素在其中，并且掌握很多的遗传信息需要在适当的条件下对其进行研发，利用一个细胞可以研发并且培育出新的植物。植物细胞工程主要就是利用植物身体中这种细胞的全面多功能特点进行研究【1】。很多的生物学家都是利用这种组培的方式来对名贵的花草等进行培育，并且预防植物生长中的病虫害，同时对细胞核进行重新组合之后研发出现的植物品种，整体上来讲这就是植物细胞工程。
当然其中的细胞工程主要指的是根据细胞为一个基本的研究单位对其进行繁殖与分类，按照研究者的意愿对特性进行改变与创新，从而研究出新的品种获得生产研究价值。当然细胞工程是植物细胞工程研究的基本方案，也是植物细胞工程研究重要的一部分。
二、农业生产领域中的植物细胞工程
1.植物快速繁殖中植物细胞工程的运用
植物快速繁殖主要指的是利用细胞组织的形式对植物进行简析，比去年给培养细胞养成技术来为未来的优良品种进行细胞组织分离培育，并且可以在短时期内获取大量的遗传性个体，植物快速繁殖是一种细胞培育方式。这种技术在现在的农业中使用非常广泛，特别是一些品种名贵的花草果树等使用非常频繁，并且这种还可以使用在植物杂交中，其中一旦出现有性繁殖就会对其后代进行分离，并且在繁殖的过程中还能保持自身的特点，将优势传递给繁殖的育种中。在我国已经有很多的植物等采用了这种技术其中包含马铃薯、咖啡、菠萝、柑橘等。
2.脱毒苗生产领域植物细胞工程的应用
在现在的农业生产中，很多的农作物在经过几代的种植下经常出现质量退减的现象发生，特别是在马铃薯以及蔬菜果树等方面非常明显【2】。针对这样的现象科学家研究发现导致农作物出现质量退减现象主要是因为农作物在生长期间受到病毒的感染。很多时候为了更高的获得农作物生长价值经常在生产期间会对农作物喷射药物，保证其不受到病虫害的影响，但是这样就会对农作物继续繁殖造成伤害，所以现在的农业中将重心放在培育不含有病毒的品种，称之为脱毒苗木。我国的农业生产中对这种脱毒苗木应用非常广泛，并且还在不断的扩展中，很大程度上推动了我国农业方面的发展与进步。现在这种脱毒苗技术在我国应用到了各种花卉、植物、果树等生产中，并且在生产过程中还不断的培育出果树无毒苗木等。
3.植物新品种选育中植物细胞工程的应用
对于植物的新品种选育在我国植物细胞中的应用也在不断的扩大，这种技术可以很好的推动我国农业的发展，并且还能增加农业生产价值，保证植物生长无毒无害。利用植物细胞工程将细胞进行再次分析，并且根据再次分离之后的细胞进行结合，培育出新的植物品种，结合植物自身的优势排除其中不利因素，保证植物在生长期间不受到以前植物的影响，提高农业生产的产量。
三、育种中的植物细胞工程
1.再生体系构建
在我国是非常常见的一种植物同时也是非常名贵的一种植物之一，的品种非常多，属于一种草本植物，并且还是我国传统名花之一，更是世界名花，的色彩非常丰富，并且花形优美生长品种数量非常多，自身具有很高的观赏价值，还是一种珍贵的药材。对于细胞再生体系的研究已经很长时间，并且现在不仅对其中的叶子与叶柄等进行了研究，还涉及到茎尖、茎段等再生体系【3】。的再生体系研究过程中经常利用MS作为培养的基本培养，其中包括生长调节剂6-BA与NAA。当然因为受到基因生长的限制出现一些再生体系等，所以需要进行愈合再生的研究，将植物中容易产生遗传的因素与变异细胞等进行结合，保证再生的植物能够保持优良性，还可以简化细胞培育程序，减少繁殖的时间。
2.育种过程细胞工程的应用分析
针对的细胞工程研究不断深入，对于的资源开展以及利用等提供了很多的优化措施，并且在现在的植物种植培育中对于的种植与培育更是得到了突飞猛进。植物细胞中强调转基因，这种技术在培育中的运行提高了生长的质量与抵抗力，并且强化了自身的安全系统，完成了克隆技术的发展，还对进行了深度的细胞再生研究，提高了育种的优化，保证生长的品质。从整体上来讲这种细胞工程在育种中的研究与发展不仅提升了自身生长的能力与质量，还为我国植物细胞育种提供了新的参考方案，推动植物与农作物的发展与进步。
结论：
综上所述，根据文中介绍的植物细胞工程技术以及在育种中的发展与推广，不仅很好的促进了我国植物发展生长的过程，还影响着人们正常的生活，并且为农业生产等方面提供了新的发现道路与科学技术，这样的农业植物细胞培植能够很好的提高农业生产总体的质量，促进我国生产经济的强大。
参考文献
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【摘要】目的制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法采用三硝基甲苯和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7d后，用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达，扫描电子显微镜观察其超微结构。结果支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。
【关键词】去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性
【Abstract】ObjectiveToproducetheacellularmuscleasbiomaterialscaffoldandtoobserveitsbiocompatibilitywiththehumanamnioticepithelialcell.MethodsTheacellularmusclescaffoldsweremadebyextractionwith3%TritonX100and1%sodiumdodecylsulfate.Thehistologicalstructureofacellularmusclewasobservedinfrozensection.Thentheculturedhumanamnioticcellswereimplantedintoacellularmusclescaffolds.Aftercultured1w，thescaffoldswithcellsweresectioned，andBrdU，NT3andBDNFimmunohistochemicalstainingwereperformedtoobservetheproliferatingcapacityandtheexpressionsofNT3andBDNFofamnioticcellsinscaffold.SEMwasperformedtoexaminethedistributionofhumanamnioticepithelialcellsgrowinginscaffold.ResultsThecellsinscaffoldcompletelydisappearedafterthemusclehadbeenextracted.Thescaffoldofacellularmusclewasarrangedinparalleltubulescomposedofcollagenfibersandelasticfiberswhichwereleftintact.InscaffoldthehumanamnioncellscouldproliferateandsynthesizeNT3andBDNF.Scanningelectronmicroscopydemonstratedauniformdistributionofcellsinscaffold.ConclusionsThecellsinratskeletalmusclearesuccessfullyremovedbychemicalextraction.Theacellularmusclescaffoldmadeinthiswaypossessgoodcompatibilitywithhumanamnioticcells.
【Keywords】Acellularmuscle;Humanamnioticcell;Biocompatibility
近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处，4w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4，5〕，促进神经元轴突的生长，是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物Wistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
1.1.2试剂IMDM培养基及小牛血清由Hyclone公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU)及BrdU单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3，脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。
1.2方法
1.2.1去细胞肌肉支架的制备参考Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50r/min摇48h后，转入3%的TritonX100溶液，摇床中37℃、50r/min摇48h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃、50r/min摇48h。换成1%SDS溶液，摇床37℃，50r/min摇48h。PBS洗24h。PBS中4℃保存备用。
1.2.2支架形态结构的观察及成分鉴定肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1h，5%蔗糖90min，15%蔗糖90min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE染色，观察其内部结构。此外对切片进行VanGienson(VG)染色和Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。
1.2.3人羊膜上皮细胞的培养人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素，200μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。
1.2.4人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定
1.2.4.1取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1000r/min，离心3min。用DMEM重悬细胞。用1ml注射器吸入细胞悬液，以2×106/ml密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养1w。掺入Brdu(终浓度为10mg/L)，继续培养1d后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS洗后，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶10min，血清封闭20min;一抗用BrdU(1∶1000稀释)单克隆抗体，BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS洗后，二抗37℃孵育30min，PBS洗后，SABC37℃孵育30min，DAB显色。光镜下观察。
1.2.4.2扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，镀膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。
2结果
2.1支架的组织结构与成分去细胞肌肉外观呈乳白色，半透明，质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失，而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见图1。
2.2羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性见图2，HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(图
图1去细胞肌肉支架大体与组织切片染色
图2去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示，BrdU阳性细胞数目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(图2C，2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(图2E)。
3讨论
理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似，仅在直径上略大于神经膜管〔10〕，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9，12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。
由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括胰岛素样生长因子、层黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质，IL1，IL8等因子，另外，还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞，与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀，抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。
总之，本研究成功制备了去细胞肌肉支架，并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子，人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于使神经缺损得到较好地修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。
参考文献
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8月27日，来自北京中关村生物医药园的孵化企业――北京弘润天源生物技术股份有限公司（下称“弘天生物”，832979.OC）正式登陆新三板，也使其成为国内细胞生物研究领域为数不多的上市公司之一。
在此前的8月21日，国家卫计委、国家食药监总局联合了我国首个《干细胞临床研究管理办法（试行）》，旨在规范干细胞临床研究行为，以期借此保障受试者权益并促进干细胞研究健康发展。此政策也被视作细胞研究大发展的“信号弹”。
4000亿美元市场的吸引力
“细胞生物研究与储存在医学研究及治疗、医疗美容、转化医学方面都极为重要，这也是公司多年来投身该行业的原因。上市后，公司将在北京两大研发中心的基础上进一步在全国设立样本分库。”弘天生物董事长王安祥接受《中国经济周刊》记者采访时表示。
王安祥介绍说，干细胞主要有两个特征：一是自我复制能力，即“一个变成两个完全一样的细胞”；另一个是多向分化，干细胞应用最常见的是细胞替换，比如说白血病患者做造血干细胞移植，等于换了正常的干细胞。干细胞还有特殊的营养因子，可以修复各个器官的损伤。
根据《2010年干细胞年鉴》，干细胞市场规模每年平均以34%复合增长率增长，未来20年内，干细胞全球市场规模有望达到4000亿美元。因此，干细胞市场被各路资本所青睐，“钱”景广阔，世界医药巨头纷纷布局干细胞产业。
业内人士认为，在医药行业中，干细胞作为新兴前沿领域，市场空间广阔，同时有望迎来政策激励。而细胞存储又被誉为“细胞银行”，是细胞治疗行业最基础、最前端的业务，前景广阔，谁先布局谁就将抢占行业资源先机。在细胞行业内也有不少企业都在向细胞存储业务延伸。
据不完全统计，目前国内共有200余家企业从事细胞治疗技术研发，这其中也包括上市公司如香雪制药（300147.SZ）、开能环保（300272.SZ）等，但布局都还停留在初期。
2004年开始，弘天生物与美国密歇根大学、北京大学的一些顶尖科学家搭建专业技术团队，2009年成立专业公司开始启用GMP（药品生产质量管理规范）研发实验室并做市场运作。在2013年获批国家高新技术企业后不久，弘天生物完成了增资扩股。
“细胞存储之所以被称为‘细胞银行’，是因为它是细胞治疗行业的最基础、最前端的业务，普通消费者将健康的细胞提取储存后，可至少保存20年的有效性，一旦未来有重大疾病治疗、预防性医学干预和抗衰老使用的需求，就能再度以细胞基因工程改造等先进技术进行使用。使用自己的健康细胞几乎不存在排异的情况，具有较高安全性。”王安祥对《中国经济周刊》记者表示。
目前，弘天生物斥资5亿元在北京大兴建立细胞存储基地，一期已经完成并投入使用，库容可达32万份。
试水者或将大打市场战？
事实上，我国对干细胞技术的研究工作早有所部署，比如973、863等国家科技计划涉及了干细胞项目，在科技部“十二五”专项规划中，以干细胞技术为核心的再生医学还被称为“继药物治疗和手术治疗之后的一个医疗革命”，其被认可和重视的程度可见一斑。
“弘天生物所在的细胞生物领域对于技术研发非常倚重，而这类企业往往需要在资金投入、技术储备和市场推广方面三管齐下。在大型竞争对手纷纷登陆资本市场之后，获得资金补充的弘天生物可能将大打市场战。”银河证券一位内部人士对《中国经济周刊》记者表示。
事实上，干细胞研究需要大量资金且研究时间很长，即使取得成果，也并不一定能获得巨额利润。例如世界上首个干细胞治疗药物美国哥伦比亚奥西里斯诊疗公司（Osiris）的干细胞产品Prochymal，该产品上市后销售情况一般，公司于2013年10月将该产品以1亿美元出售给Mesoblast公司。
再加上干细胞产业极其“个体化”，不管是做基因检测、基因治疗，还是细胞治疗、免疫治疗或组织工程，都需要以自己的细胞、组织为原料，与传统医药工业的批量化模式有很大的区别，需要全新的基础设施和商业模式。
很多企业巨资投入后最终输出的产品分别面向两块完全不同的市场，在生物科技行业极为火热的CRO（向药企提供新药临床研究服务）与转化医学领域。包括无锡药明康德、博济医药等一众本土企业均以上述两项作为业务核心，弘天生物也不例外。
1单细胞分泌实时测量的新方法
细胞分泌活动的传统研究方法主要采用ELISA、RIA、FACS等阶段性定量测定或冰冻蚀刻电镜技术、普通光学显微镜技术等形态学研究方法,都属于非现场静态研究,并且是大量细胞共同3期娄雪林等:免疫细胞分泌研究进展生理学报ActaPhysiol.Sin.54卷测定。近年来,各种实时监测技术的发展极大地促进了人们对细胞分泌机制的了解。下面就目前常用的三种细胞分泌实时检测技术的原理、方法以及优缺点作简要介绍。
1.1膜电容测量
近10年来,膜电容检测技术在研究细胞胞吐和胞饮机制方面得到了越来越广泛的应用［1］。细胞分泌的最后一步是囊泡膜与胞浆膜融合的过程,当分泌发生时细胞膜的表面积会增加,而细胞膜的电容大小正比于细胞膜的表面积(～1μF/cm2),因此细胞膜电容的增加就代表细胞分泌量。这种技术对囊泡分泌的时间分辨率极高(～ms),常用来研究分泌事件与离子通道活动以及细胞内第二信使的关系。最近出现的细胞贴附膜片电容技术,膜电容分辨率可达到0.1fF,能检测到直径60nm的小囊泡分泌［2］。这一方法为研究单个小囊泡的分泌活动如膜融合孔开闭动力学、膜融合事件的分子调控等提供了强有力的工具。由于胞吐后囊泡膜的回收会导致膜电容的减少,因此膜电容检测技术也能提供囊泡胞饮过程的信息。
膜电容测量技术可用于神经细胞、内分泌细胞、免疫细胞等大多数细胞的分泌测量,而且测量精度和时间分辨率都较高,但该方法不能排除胞吞对胞吐检测的影响,并且对试验条件如封接电阻(Rm)、串联电阻(Rs)的要求很高,对于一些较复杂结构如神经轴突终末、与周边细胞有电学偶联的细胞等则不能用该技术进行研究。
1.2电化学测量
用电化学技术监测细胞分泌的原理是:在电极尖端表面施加一定的电压,容易氧化的化学信使物质就会在电极尖端释放出电子而发生氧化,电极可获得电子并产生一定的电流［3］。微电极的电流大小与电极尖端面积和实验类型有关,一般在pA到nA范围,通常采用膜片钳放大器等低噪声仪器进行检测。对单个分泌电流峰积分即可估算出每个囊泡中包含的递质分子数,即量子包装的大小。施加的电压可为恒电位或三角波循环电压,前者的优点是时间分辨率高,后者的优点是能区分不同的信息分子。在单细胞胞吐测量时两种方法可以互相补充。目前儿茶酚胺、5-HT、胰岛素、组胺、nO以及含色氨酸或酪氨酸残基的多肽激素或递质都可直接或间接地使用该方法检测［16］。
电化学技术监测分泌的最大优点是时间分辨率高(ms级),能监测单个囊泡的释放以及囊泡中的递质含量,且较膜电容测量更为直观;其次具有一定的细胞空间分辨率,可用于测定细胞释放热区(hotspot);另外,该方法对细胞无损伤,可进行长时间监测。但是电极只能检测到少部分信息物质(10％左右),而且对于那些不能被氧化的物质的释放不能直接检测［16］。本方法常与膜电容方法联合应用来研究分泌事件,以相互补充。
1.3细胞分泌的光学测量
用普通光学显微镜只能检测巨大囊泡的分泌过程,而新的荧光染料的开发和显微成像技术的发展使实时监测小囊泡的分泌成为可能［4］。FM1-43和FM4-64等是有效的研究分泌活动的选择性膜表面荧光标记物,它们在水相中没有荧光,当它们插入脂质膜后则显示较强的荧光,囊泡膜胞吐后会使细胞表面荧光增加,而胞吞回收的囊泡因吞进细胞周围的染料而被荧光标记,这样便能够实时观察细胞的胞吐及胞吞过程。本方法的缺点是背景荧光较大,fM染料目前尚不能用于脑片等组织切片的分泌研究。另一种方法是通过基因转染方法将荧光基因如绿色荧光蛋白(GFP)基因转入靶细胞中并选择性地在囊泡中表达,然后用激光扫描共聚焦荧光显微镜等检测囊泡的运动过程［5］。例如,将GFP基因与囊泡特异的前胰岛素基因整合后转入胰岛INS-1β-细胞中进行表达,然后用荧光成像技术实时研究活分泌囊泡的转移、锚定和胞吐过程。此外还有免疫荧光标记法:多巴胺β羟化酶(DBH)在嗜铬细胞分泌囊泡中是一种主要的膜蛋白,由于它在胞吐中会出现在细胞膜的表面,随着它与胞外液中荧光标记的DBH抗体的结合,就能观察到胞吐位点在细胞膜上的分布以及囊泡膜的回收过程。1.4胞内信号分子光解方法
细胞分泌活动受很多因素的调控,采用信使物质瞬时释放的方法［6］,可以定量研究各因素对分泌的影响。神经递质的分泌与细胞钙离子浓度紧密偶联(与钙离子浓度的3～4次方成正相关)。Ca2＋螯合物DM-nitrophen和NitrophenyleGTA可用于快速而均匀地提升细胞内钙离子浓度,将这些物质与Ca2+染料通过膜片钳电极或孵育的方法导入细胞内,然后经高能量的紫外光激发,便能产生一个迅速的、阶跃性的钙升高,并且整个细胞钙浓度都会均一地升高。这克服了单纯电刺激引起的离子通道附近产生不同的钙微区的缺点。DM-nitrophen在光解前对Ca2+有很高的亲和力,对静息的细胞钙缓冲几乎没有影响,是研究细胞钙缓冲和钙稳态系统的非常理想的材料。通过控制激发紫外光的强度,可以用来进行细胞内钙离子浓度滴定,也可用于钙结合力测定以及其他许多钙依赖的细胞功能活动。但是它易受Mg2+结合的影响。而NitrophenylEGTA对Ca2+有更高的选择性,但它在光解前对Ca2+亲和力较低,且不易被光解产生大的Ca2+阶跃。除了Ca2+外,许多第二信使如cAMP等都可用该方法对其细胞内浓度进行精确控制。
2免疫细胞分泌的细胞和分子机制
2.1免疫细胞的离子通道和细胞功能
免疫细胞不属于可兴奋性细胞(如神经细胞、肌肉细胞等)之列,但也具有某些与神经细胞相类似的电生理特性。离子通道的活动与离子跨膜流动、膜电位的变化以及随后的淋巴细胞激活密切相关。在大多数淋巴细胞上存在有不同的离子通道,这些离子通道类似于神经细胞以及肌肉细胞的离子通道,但又有其自身的特点。Na通道仅存在于少数T细胞、T细胞株和自然杀伤细胞。电压依赖性K通道存在于大多数T淋巴细胞、T淋巴细胞株和巨噬细胞［7］,类似于神经细胞上的延迟整流K通道特性。根据其电压激活和灭活的动力学特性以及药理学特征可分为3种亚型,它们随细胞的发育状态和功能分类不同而有所变化,可能与细胞有丝分裂有关。丝裂酶原刺激后24h可使K电流增大;K通道阻断剂则能剂量依赖性地抑制有丝分裂和抗原引发的淋巴细胞的激活,可能是“K通道开放-细胞膜去极化-Ca2+通道开放”通路被抑制后细胞外Ca2+内流减少所致［8］。Ca2+激活的K通道K(Ca)则由丝裂酶原引起的细胞Ca2+浓度升高激活,进而引发K外流和细胞膜的超极化。电压依赖性Ca通道仅在B淋巴细胞上存在,而在T淋巴细胞以及T淋巴细胞株均未见报道;但T淋巴细胞上存在一种非电压依赖性的Ca2+通道,由T细胞抗原所激活,然后通过第二信使IP3,引发细胞内Ca2+库释放,增强Ca2+离子跨膜内流或Ca2+依赖性灭活。
目前,Ca2+作为细胞内较早激活的一个重要的第二信使已被接受,但其后续信号过程尚不清楚。T细胞的Ca2+信号可分成两相:快速的Ca2+峰和随后的Ca2+平台,前者由细胞内钙库的释放引起,后者则由CRAC引发的持续跨膜Ca2+内流引起。单细胞上的钙信号可表现为反复的钙振荡,这可能是一种通过频率编码来传递信息的方式。钙信号的频率特性可通过几种非线性反馈系统来调控,如PKC介导的CD3γ亚基的磷酸化负反馈(可反馈抑制TCR/CD3的功能)、ca2+信号放大正反馈(内质网Ca2+的释放和同时发生的CRAC以及PLC的进一步激活)、ca2+离子的自身负反馈。关于G蛋白是否介导“TCR/CD3-PI水解-Ca2+动员”信号通路,尚是一个悬而未决的问题,一些间接证据表明T细胞的激活需要G蛋白的参与,TCR/CD3可能在结构上形成G蛋白偶联受体［9］。联合应用膜片钳技术、单细胞荧光测量以及报告基因(如GFP、rFP)等研究方法,有望阐明免疫细胞的信号转导、淋巴因子的分泌机制和其他相关的细胞功能。
2.2免疫细胞分泌抗体或细胞因子的研究
经过适当处理,免疫细胞可应用膜片钳测量细胞膜电容。膜电容正比于细胞膜表面积。当分泌小泡与细胞膜溶合并胞吐时,便伴有膜电容的增加。人的中性粒白细胞是成功应用whole-cell和on-cell膜片钳法进行研究的少数免疫细胞之一［10］。通过膜片钳电极向细胞内导入GTPγS,可引起膜电容从静息时的3pF增加到8～9pF。有趣的是虽然GTPγS导入可引起暂时的Ca2+浓度升高和膜电容的增加,但当加入高浓度的Ca2+缓冲物质将钙升高阻断后,膜电容的升高依然存在而不受Ca2+离子的影响,表明GTPγS引起的分泌不需要Ca2+离子的参与,属于Ca2+非依赖性分泌,这与经典的Ca2+依赖性分泌明显不同。进一步研究Ca2+和GTPγS的促分泌效率的差别和他们分别在什么情况下起作用将是一个重要课题。当向细胞导入高浓度Ca2+时,分泌过程呈现2种不同的动力学成分,第一相只需要1～10μmol/L的Ca2+,而第二相则需要100～300μmol/L的Ca2+浓度,他们分别对应免疫细胞内不同性质的囊泡,即不同的Ca2+浓度控制不同的囊泡分泌,以适应不同的细胞功能。
lollike等［2］应用细胞贴附式膜片钳技术在中性粒白细胞研究了免疫细胞脱颗粒的动力学,包括单个囊泡融合的动力学特性,用这种方法,他们可以分辨出1fF的阶梯状电容变化(对应单个囊泡分泌事件)。在形成封接后,他观察到一种自发的阶梯状膜电容降低,代表直径60～165nm的囊泡小泡的内吞。当用Ionomycin刺激后,可观察到0.1~5fF大小不等的阶梯状电容升高,代表了白细胞不同类型囊泡的分泌(图2)。对于直径＞180nm的囊泡可以直接观察到单个融合孔活动,融合孔起始平均电导为150pS,最小的仅有35pS,随后融合孔逐渐扩大,扩展速度有快有慢,与报道的巨大的囊泡融合孔特性类似。这是首次直接观察到直径＜500nm的小囊泡的融合孔,根据其起始电导小的特征,可以推测融合孔的形成必须有蛋白质参与。免疫细胞融合孔也存在闪烁开闭(flicker)的现象［11,12］,这表明小囊泡的胞吐是可逆的。在融合孔闪烁过程中,其电导通常＜1ns,并且在开和关两种状态的大小是一致的,这表明中性粒细胞的融合孔在低电导时不存在细胞膜脂质的流动;这与肥大细胞上的研究结果不同,后者闪烁更快［13］,融合孔打开值较关闭时的值小,存在细胞膜脂质不断转移到囊泡的现象［14］。Lollike还发现一种假闪烁(pseudoflikers)现象:单个囊泡融合后会观察到一种渐进性的膜电容下降,其原因尚不清楚,可能是几个直径＜60nm的小囊泡的快速融合的结果,也可能是电极内的小部分膜片逐渐贴到电极壁上所致。关于膜融合孔调控的分子机制研究还刚刚起步。马的嗜酸性白细胞含有巨大囊泡,它的融合孔的扩大可由Ca2+和PKC通过不同的机制进行调节［15］;粒细胞的融合孔似乎在开放状态下也受到蛋白质的调控,而中性粒细胞的融合孔的调控机制尚是空白。与融合孔的研究相比,对膜分裂孔(fissionpore)的研究非常有限,因为胞饮囊泡通常非常小,不能被全细胞膜电容记录所分辨,而细胞贴附式膜电容记录可分辨出单个囊泡的胞饮,Lollike已经分辨出直径300～700nm的小囊泡分裂孔［2］。该研究的进一步深入,有望揭开囊泡融合晚期分子活动的神秘面纱,这不但对细胞免疫学而且对神经科学和内分泌学都意义深远。
受whole-cell技术约束,许多免疫细胞还不易用膜电容记录。但较新的微碳纤电极(CFE)技术可能弥补此缺。这种电化学方法灵敏度极高,可检测到单个小泡分泌［16］。
2.3免疫细胞分泌功能的调控
免疫系统是生物体的防御系统,免疫细胞抗体和细胞因子的分泌受到细胞内信号分子和细胞周围微环境的精确调控。对肥大细胞的研究表明,PKC活性是调控肥大细胞脱颗粒的重要因素［17］。肥大细胞激活后,细胞内多个信号转导通路被激活,导致炎症前细胞因子立即释放和其他细胞因子的延迟性释放。这一过程除需要激活酪氨酸激酶(tyrosinekinase)外,还需要PKC的激活来使丝氨酸和苏氨酸磷酸化。对于PKCβ缺陷的小鼠,IL-6的分泌反应消失或减弱,而IL-3引发的肥大细胞增值反应和凋亡率不受影响。Cho等［18］用BLT酯酶分析(BLTesteraseassay)在NK细胞的研究表明:细胞粘附分子ICAM-1能够抑制IL-12引发的NK细胞的脱颗粒和细胞毒性作用,人ICAM-1抗体R6.5mAb能阻断这一作用;fluo-3AM荧光测量的结果表明上述过程为Ca2＋依赖性分泌,ICAM-1能抑制NK细胞的Ca2＋离子内流。MHC-I类抗原NK细胞受体可抑制NK细胞的脱颗粒和自然杀伤作用,但是尚不清楚是哪种特异性受体介导了这种作用,以及这些受体是否影响细胞因子分泌等NK细胞的其他功能。最近的一项研究［19］表明,Ly-49A受体能调控NK细胞的囊泡胞吐和细胞因子的分泌,在NK细胞介导的细胞毒性作用过程中，作为MHC-I分子的一个抑制性受体而存在,而且仅通过由Ly-49A介导的信号转导过程就足以产生抑制效应。
90年代分泌机制的研究获得了突破性的进展,发现细胞分泌的关键蛋白质复合体SNARE是导致包括神经元、内分泌细胞和免疫细胞在内的各种细胞分泌发生的共同分子机制［20］。
在可兴奋性的神经和内分泌细胞上,分泌活动对Ca2+浓度呈3～4次方的依赖性,因此稍微提高膜融合分子与Ca2+的亲和力即有可能触发分泌。细胞可能通过不同种类囊泡的空间定位差异来实现特异的调控,也可能通过囊泡对钙离子的敏感性或其分泌动力学特性的不同来调控不同分泌活动。小囊泡由于其Ca2+阈值高和分泌速率快,瞬间升高的Ca2+信号更能有效地触发其分泌;而大囊泡的分泌则更依赖于缓慢的幅值较低的Ca2+信号。区分不同囊泡动力学特性和Ca2+依赖性有助于了解不同分泌囊泡的分泌调控机制。当然细胞也可能通过不依赖Ca2+信号的其它信号系统来直接调控不同的分泌,例如PKC的激活可触发分泌［21］,g-蛋白偶联的受体latrophilin也可在无明显Ca2+信号升高的情况下触发分泌［22］。许多免疫细胞如T细胞、B细胞、肥大细胞、巨噬细胞等受到刺激后可以立即脱颗粒,释放其炎症因子, 这一过程涉及的分子众多,其分泌调控的复杂性不亚于神经细胞。
最近,Paumet等［23］在RBL-2H3肥大细胞株上对细胞胞吐的SNARE分子机制进行了研究,发现了几种SNARE蛋白质复合体的异构体表达,其中一种23kDa的SNAP(SNAP-23)对SNARE的形成非常重要。在syntaxin家族中,syntaxin4能够与SNAP-23以及其他的VAMP蛋白质分子,但不能与破伤风毒素不敏感的VAMP(TI-VAMP)结合。Syntaxin4的高表达能抑制FcepsilonRI依赖的的分泌活动,而syntaxin2和syntaxin3均无此作用。细胞内膜结构上存在4种VAMP蛋白:VAMP2、cellubrevin、tI-VAMP和VAMP8,其中以VAMP8对细胞胞吐活动最为重要。这一研究首次表明,非神经元性的VAMP8异构体(最早在早期内体上发现)参与分泌囊泡的调控。
chen等［24］对血小板分泌的分子机制进行了研究,揭示了SNAP-23在Ca2+引发的致密颗粒释放中的作用。血小板含有几种t-SNAREs,如syntaxin2、syntaxin4、syntaxin7以及SNAP-23等,Ca2+引发的分泌可以被重组的α-SNAP加强而被抗NSF抗体所抑制;sNAP-23抗体或者抑制性C末端SNAP-23肽(inhibitoryC-terminalSNAP-23peptide)都可以致密颗粒的胞吐。在抗syntaxin抗体中,只有syntaxin2抗体可以抑制致密囊泡的释放,免疫沉淀印迹的结果证明在体内2个syntaxin2和SNAP-23结合形成一个复合体。上述结果表明,sNAP、NSF以及特异性t-SNARE都参与了致密囊泡脱颗粒过程。
3免疫细胞的分泌活动和免疫-神经-内分泌网络
免疫系统、神经系统以及内分泌系统之间的关系非常密切,呈现一种复杂的相互影响的调节网络:即“神经-免疫-内分泌网络”,其中主要由激素、神经递质、细胞因子三种物质来传递信息,而这些信息分子的分泌是三者相互联系的一个基本环节。
免疫系统的稳定最终可归结为免疫因子分泌的平衡。免疫细胞的分泌活动除了受自身的调控外,还受神经和内分泌系统的调节。形态学研究表明,在几乎所有免疫细胞上都有不同神经递质和激素的受体,同时许多种神经递质和激素受体在免疫细胞上都有分布。功能研究表明,很多激素和神经递质具有免疫调节功能。例如,肾上腺皮质激素就是最早发现的具有免疫调节功能的一种激素,它对淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞都有抑制作用。而生长激素(GH)对几乎所有免疫细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞、胸腺细胞等都有促进分化和加强功能的作用。另一方面,免疫系统可以影响神经和内分泌系统。免疫细胞可以分泌多种细胞因子如淋巴因子和单核因子等,而在神经和内分泌细胞上有相应的受体接收免疫系统的信息。
细胞因子和神经递质以及激素的多功能位点特性是其神经和免疫调节的分子基础。基因点突变的研究表明:IL-2分子具有相互独立的免疫功能位点和镇痛功能位点,而作为神经递质的内啡肽也有相互独立的镇痛和免疫调节结构域。除此之外,许多细胞因子和递质都有多功能位点特征。另一方面,细胞因子除了具有多功能位点特性外,还具有多受体介导机制,即同一种细胞因子可作用于不同的受体而起到神经调节或免疫调节的作用,如IL-2的中枢和外周镇痛作用可以被纳洛酮阻断,而其增值CTLL-2细胞的作用却不受影响。
细胞因子的分泌作为免疫系统信息调控的上游过程,便成了“神经-免疫-内分泌网络”的一个基本而重要的环节,免疫细胞活性物质的分泌不但受到免疫系统自身的精确调控,而且受到神经系统和内分泌系统的严格调节,其中涉及的细胞和分子机制十分复杂,相关的研究也处于探索阶段。
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AbstractItisquickconvientgood-repeatingandcheapthatexaminingthebioticmaterialscompatibilitythroughcell-culturingmethod,anditismoreandmoreimportantinevaluatingthecompatibilityofbioticmaterial.Thenewmaterialappeatingcontinouslycomplicatingofthepartandaimmaterialbeplantedintheintensityofmaterialstoxiceffectthereactionscomplicationofmaterialandbioticbody,allofthesedecidethevarietyofexperimentmethodandcellsincelltoxicityexperiment.Itisveryimportantthatchoicestherightexperimentmethodandcellsaccordingtothematerialscharacterthepartandaimthematerialbeplantedin.Theevaluationofbioticmaterialscompatibilitystressedonthechangingofcellsformandquantitybefore.Inrecentyears,moreandmorereportsappearaboutmaterialinflueancesthegrowth.adhesionproliferationandmetabolizingofcell.andpresentsthepointthattheevaluationstandardofbioticmaterialscompatibilityshouldbesetaccordingtotheactivecellsquantityandtheirbiningmanysubjectstechnologicaldevelopment,suchasimmunology,chemistry,radiationandshadowgraphy,thoroughlyinquiresthechangeingrelationofcellsstructureandfuntion,furtherlyclarifesthematerialseffectoncell,Itisthedevelopingdirectioninthefuturethatevaluatesthebioticmaterialscompatibilityincedd-culturingmethod.
KeywordsBioticmaterialCell-culturingCompatibilityToxicityexperiment
生物材料的临床应用已有较长的历史，广泛应用于牙科、眼科、整形外科及心血管外科领域。目前美每年有2-3百万人工脏器或假肢植入人体中。生物材料不仅要具有临床使用时所需要的理化性能，还必须具有良好的生物相容性，以保证使用安全。如何快速准确地评价材料的生物相容性，对于研制新材料和缩短研究周期起着重要的作用[1]。
根据1982年美国国家标准学会和牙科协会（ANSI/ADA）公布的评价生物相容性实验标准草案，评价生物相容性的实验方法有全身毒性试验（口服法）、急性全身毒性试验（静脉注射法）、吸入毒性试验、溶血试验、皮下植入试验、骨内植入试验、过敏试验等[2]。细胞培养法作为检测材料毒性的手段（亦称为细胞毒性试验），具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点，正日益受到人们的广泛重视。本文就该研究领域近几年的发展及动向作一简介。
1细胞毒性试验方法的进展
1948年RosenBluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物，开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作，迄今为止这方面已有大量的工作积累与研究发现。细胞毒性试验在评价材料生物相容性地位已得到公认[3]。由于目前对生物相容性概念及机理还完全了解，加之材料的多样性、置入要体内环境中的变异性、材料与机体作用的复杂性等因素，故迄今为止，国内外还没有一个统一细胞毒性试验方法。
细胞毒性试验由于细胞培养方式（如单层细胞培养、细胞悬液与材料混合培养、细胞在材料上培养等）的不同，细胞与材料之间有无间质（即细胞直接与材料或其浸出液接触，还是通过间质接触）以及材料毒性成份（即材料本身、浸出物、扩散物或材料降解产物等）不同决定了细胞毒性试验方法的多样性。根据细胞和材料之间有无间质可以将细胞毒性试验方法分为间接法与直接法两大类。
1.1间接法
最典型的间接法是琼脂覆盖法，该法是Dubecco在1952年首先提出[4]。其方法是将含有培养液的琼层平铺在有单层细胞的培养皿中，再在固化的琼脂层上放上试样进行细胞培养。此法优点是不管试验材料是什么形态（膜、粉末或油脂状）等都适用。但该法敏感性受试样溶出物琼脂层上扩散程度的影响。当溶出物分子量小，易溶于水，其毒性发现早且较强。反之即使有毒的材料，如溶出物分子量大并难溶于水，使用该法时材料毒性就难以表现出来。
为克服琼脂法的缺点，SabitaSriva等提出分子滤过法[3]。该法是在单层细胞上覆盖一层丙烯盐制成的微孔滤膜，将试样材料放在滤膜上，使材料毒性在成份通过滤膜作用于其下的细胞。由于滤膜微孔直径约0.45μm,Bondemark认为该法适合评价毒性成份分子量小的材料的相容性[5]。vanLuyn等1992年报道用甲基纤维素细胞培养法评价聚合物的细胞毒性[6]。该法是在甲基纤维素中混入细胞表面进行培养。该法优点是生物材料的水解及细胞坏死释放出的蛋白分解酶引起的酶解作用均要发生，因此可同观察到生物材料的原发性及继发性细胞毒性。
1.2直接法
生物材料中一些易溶出物质引起炎症反应和组织反应的主要原因。易溶出物质一般是原料单体、低分子聚合物、催化剂、溶剂、稳定剂、乳化剂等。为研究这些溶出物的细胞毒性，一些学者提出浸出液法。该法是将试样投入培养液或蒸馏水中适当条件下进行浸泡，制备出含有溶出的浸泡液再将浸了液加在含有细胞的培养皿或试管中继续培养，观察溶出物对细胞的影响。Oshima认为不同浸提条件和浸提方式所制备的材料溶出物在细胞敏感程度上并无显著性差异[7]。
直接浸渍法：该法是形态不规则的试样（如金属粉末、油脂类材料）等与细胞一起放入培养皿中进行培养。当有溶出物时试样周围的细胞就会受到影响。宁淑华等1988年用该法对医用硅胶及聚乙烯醇进行细胞毒性试验[8]。作者认为对于形态不规则有微量毒性的材料使用该法较为适宜。
另一些学者在直接法基础上提出直接接触法。该法将细胞直接放在生物材料上进行细胞培养。当有毒性物质释放时，由细胞形态变化和数量增减检测细胞毒性程度，同时可以直接观察到细胞在材料表面贴附情况。直接接触法不仅能直接检测材料溶出物的细胞毒性，同时也是考察材料与组织细胞相容性的重要手段。通常“材料生物相容性好”，很多场合都是指细胞容易贴壁且能迅速繁殖生长。因此可根据直接接触法细胞培养的结果推测材料植入人体后与机体细胞的反应。但是，对于与血液接触的循环系统来说，为了避免引起血栓形成，就希望细胞难以贴壁且不易增殖。因此应根据材料的使用目的，作出相应的生物相容性判断。
Tsuchiya[9]等于1994年对琼脂法、分子滤过法、浸出液和直接接触法对材料的细胞毒性敏感程度的差异性进行比较。作者认为浸出液法适合检测材料溶出物毒性，并与动物毒性试验结果相符合。直接接触法对材料的细胞毒性敏感性最高，可测出材料微弱的细胞毒性。琼脂法适合对毒性大的大指材料进行筛选。分子滤过法适合毒性成份分子子量小的材料进行生物相容性评价。
综上所述。细胞毒性试验方法多种多样，并各有其特色。每种试验方法因其原理及方法不同，选择材料的针对性也不同。根据实验材料本身理化性质、毒性成份表现形式、毒性作用强弱及材料用途选择正确的实验方法是至关重要的。
2实验细胞研究进展
目前细胞毒性试验中应用最早的及使用最广泛的细胞是L-929细胞，该细胞是Earle等1948年从小鼠皮小组织中分离出的成纤维细胞。另一种应用较多的细胞是Gey等1953年从人类子宫肿瘤中分离出的子宫粘膜上细胞（HeLa细胞）[10]。由于这两种具有传代容易，繁殖迅速、体外培养条件低、易储存，同时这两种已建立成系的细胞株能为实验提供稳定传代的细胞，能为许多材料细胞毒性评价所共用等优点。1982年美国质量标准协会将L-929细胞和HaLe细胞推荐为细胞毒性试验中的标准细胞[2]。
由于L-929细胞来源于小鼠的皮下组织，HaLe细胞来源于人的肿瘤组织。这两种已建立成系的细胞株都具有无限分裂增殖类似肿瘤细胞的特征。因此人们对利用这现两种细胞代替人体正常组织细胞评价材料的生物相容性的敏感性及可靠性产生了疑问。同时随着不断涌现，人们对材料植入人体后与机体组织之间可能发生的反应其对材料的影响产生了浓厚的兴趣。因此单用L0929和HaLe细胞培养检测材料的生物相容性已不能满足人们的这种需要。
从九十年代起越来越多学者根据材料植入体内的不同部位及使用目的选择人体不部位或/和组织来源的细胞作业实验细胞，使体外细胞培养对机体内环境的模拟更趋真实，其结果更为准确与客观。
对宿主而言植入宿主体内的生物材料是种异物，因此材料植入体内最普遍和最常见的反应是免疫排斥反应。由于单核巨噬细胞来源于人体的血液，在人体免疫系统中起着重要的作用，能释放各种刺激因子激活补体引起急慢性炎症反应，同时刺激成纤维细胞生长促进伤品的愈合。因此选择单核巨噬细胞作评价材料细胞毒性的实验细胞，有助于人们了解材料置入体内引起的炎症反应对组织细胞的影响[1]。
Cheung认为不同组织来源的细胞材料的敏感性是有差异的[12]。只用软组织来源的细胞培养检测材料的细胞毒性尚不能全面反映出材料的生物相容性。以骨替代材料和牙用材料为例。前者种植到骨组织内，所接触的是骨环境，而后者存在于软组织环境中。因此骨替代材料应选择骨组织来源的细胞，因为这种细胞在体外培养中可形成体内环境一致的矿物化小结，这种小结内含有类成骨细胞和类骨髓细胞及钙化的胶原基质，使体外细胞包培养更好地模拟了生物材料与骨组织在体内的反应。牙用材料可释放一些可溶性的毒性成份如Na+、Ca2+、Al3+和氟化物等[]14，这些可溶物质主要影响邻近的牙组织及口腔粘膜的上皮细胞、成纤维细胞及各种免疫细胞，并对这些细胞的生长、附着增殖及代谢等功能产生影响。因此对牙材料采用口腔粘膜的成纤细胞或/和上皮细胞才能更准确地反映出材料的生物相容性。
3细胞毒性的观察方法
以往对材料生物相容性的评价往往着眼于细胞的形态与数量，通过细胞形态的改变和数量的增减判断材料的细胞毒性[15]。由于材料毒性成份对细胞的损伤，首先发生细胞生物化学反应和生物分子结构的改变，出现代谢和机能的改变如线粒体氧化代谢障碍、蛋白质合成下降，细胞膜选择性通透屏障作用消失等，这种变化用形态学方法通常不能发现。只有当细胞死亡10h以上，细胞的自溶性变化相当明显的才能在光显微镜下根据细胞死亡的判断特点，即核浓缩、核碎裂、胞浆伊红染色等判断材料的细胞毒性程度。因此传统的细胞毒性观察方法不能及时、准确地判断材料的细胞毒性。
九十年代以来，越来越多学者倾向于从材料毒性成份引起细胞死亡所产生的细胞形态和数量的变化评价材料生物相容性转移到材料对细胞的生长、附着、增殖及代谢功能的影响，并提出了以存活的有功能的细胞或/和细胞生长增殖情况作材料的生物相容性评价指标。
在体外细胞培养中已有学者提出一些能敏感地反映细胞活力功/和细胞殖的实验室评价方法。如放射性位素（3H-胸腺嘧啶，3H-亮氨酸等）摄入法[16]、荧光染色法（如乙酰乙酸荧光素）[18]、流式细胞光度术等[19]。这此方法各有其优缺点及适用范围。
放射性同位素摄入法是在培养基中掺入3H-胸腺嘧啶或/和3H-亮氨酸等，根据3H-胸腺嘧啶在细胞内含量测量DNA的合成含量，3H-亮氨酸含量测定细胞内蛋白质合成清况[16]。该法能揭示细胞分子水平的动态变化，是研究细胞代谢状态的重要手段。但同位素物质对研究人员会造成一定程度的放射性损害，同时需要特殊设计的实验室和一些特殊设备是其缺点。
四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法（MTT法）是由Mosroann在1983年提出，最初应用于免疫学领域，近年一些学者将该法应用到生物相容性评价中[20]。其原理是线粒体琥珀酸脱氢酶能催化四甲基偶氮唑盐（MTT）形成兰色甲替。形成数目的多寡与活细胞数目和功能状态呈正相关，该法简便迅速、不接触同位素、而敏感性同位素法接近。该法缺点是甲替有时易聚集成团影响结果的难确性。
荧光染色法：其基本原理是当细胞受到损伤时，细胞膜的选择通透性屏障作用消失，利用乙酰乙酸荧光素和溴化乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。在荧光显微镜下迅速区分受损细胞[22]该法特点适合评价首先影响细胞膜功能的材料的生理相容性。
流式细胞光度术（Flowcytometry,FCM）是近几年迅速发展起来的分析细胞的方法[22]。该法利用鞘流原理，使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单列，按重力方向流动。细胞被激光照射后反射荧光，检测器械可逐个结细胞的荧光强度进行测定。FCM对细胞测定能力30-60万个细胞/分钟，同时可对细胞的核酸，蛋白质、酶、细胞周期分布等八种量进行测定。该法在材料的生物相容性评价中有着广泛的应用价值。
关键词：脂肪干细胞；来源；整形美容；应用
中图分类号：R622文献标识码：A文章编号：1004-4949（2013）04-00-02
1脂肪干细胞介绍
1976年Fridenstein等首先报道从骨髓中分离出克隆源性的具有多向分化潜能的基质细胞-骨髓间充质干细胞。Zuk等于2001年发现脂肪组织中除了含有已经定型的前脂肪细胞外，也包含一种具有多向分化潜力的细胞群，其性质与MSCs十分相似，但又不完全相同。
这些细胞已被证实不仅具有分化成为骨骼、软骨、脂肪、心肌、神经等组织的能力，而且同样具有促进伤口愈合、损伤组织细胞再生和减少疤痕的能力及抗衰老能力。
这种细胞被称为脂肪来源干细胞、脂肪来源成体干细胞、脂肪来源成体间质细胞、脂肪来源间质细胞、脂肪间充质干细胞，成脂肪细胞等等。现在被统称为脂肪源性干细胞。
2脂肪干细胞研究应用的优势
作为以修复重建为主旨的整形外科及以年轻化为核心的美容医学，再生医学一直是备受关注与研究探索的领域。由于MSCs获取途径与疾病治疗性价比的差异，整形外科领域再生医学研究与临床应用受到限制。脂肪源性间充质干细胞一经报道，首先在整形外科领域引起轰动效应，这种关注大大推动了ADSCs的研究，它的临床应用也正在追赶着MSCs的步伐。
首先，来源取材方便不仅是ADSCs一个最大的优势，也是整形外科的优势。一方面，脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富；另一方面，吸脂术是整形外科成熟的常规手术，手术风险小，其作为常规“废弃的副产品”获取容易。
对患者来说，吸脂雕塑体形的同时享受干细胞的年轻化神奇功效是一次双赢的生命重塑，痛苦与恐惧感少于骨髓提取，亦无血源污染与免疫排斥风险，由此形成临床应用的优势。据国外报道，1994～2000年开展吸脂术的初期阶段，进行的66570例吸脂手术中，死亡率为0，发生医疗事故的比率也仅有0.68‰，可见吸脂术是安全可靠的。
ADSCs的第三大优势在于其较高的获取效率。骨髓中MSCs产量相对较低，在成人骨髓组织的有核细胞中仅占0.0001%～0.01%。而脂肪组织经胶原酶消化后，脂肪细胞作为其中主要的细胞类型，很容易通过浮力而去掉，所获得的细胞克隆形成率是骨髓间充质干细胞的100～500倍。同时，由于吸脂量可根据需要成倍增加，一次即可获取所需干细胞浓度，无须体外扩增，大大减少了传代变异与各种污染的风险。
3ADSCs在整形美容领域的应用研究
3.1皮肤无瘢痕研究
皮肤无瘢痕研究在ADSCs还未出现就一直是整形修复重建领域的研究重点。损伤组织细胞的完全再生与病损组织细胞的完全替代是医学领域再生医学研究的核心内容。ADSCs不仅很快就取代组织工程中的普通种子细胞，而且显示出正在进入无瘢痕研究中的重要角色。
在正常的创伤愈合过程中，成纤维细胞合成和分泌以Ⅰ型胶原纤维为主的细胞外基质，胶原的合成代谢与降解代谢之间维持着平衡状态，无论是胶原合成的增加或者降解的减少都会导致胶原的大量堆积，最终导致增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩的形成。
主要合成和分泌胶原纤维的（肌）成纤维细胞，在细胞增殖和凋亡之间也维持着平衡状态。在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中这种平衡被破坏，成纤维细胞的增殖超过了凋亡，胶原的合成明显超过降解，最终导致大量的胶原堆积。
有研究报道，表皮干细胞有可能参与瘢痕形成。从人皮肤创伤愈合机制研究推论，表皮干细胞在创伤修复与瘢痕形成中是活化的成纤维细胞的一个来源，随着创伤后某些促纤维化细胞因子（TGF-β等）水平浓度的增加，表皮干细胞在其诱导下逐渐向成纤维细胞转分化，并具有成纤维细胞的功能，合成胶原，引起细胞外基质的合成及胶原的沉积，从而不仅参与了上皮修复，而且很可能进入真皮层参与瘢痕形成。
而MSCs体外培养扩增后，标记BrdU，再回植到猪的全层皮肤缺损创面。结果显示，在创面微环境作用下，MSCs可能分化为血管内皮细胞，参与创面修复过程中肉芽组织小血管的形成，从而参与瘢痕形成。而在有关蝾螈肢体再生的研究认为，上皮在抑制瘢痕肢体再生过程中具有重要作用。
3.2ADSCs与年轻化
干细胞的年轻化作用设想源于3个研究结果。首先是iPS细胞，2007年11月，美国和日本科学家分别宣布独立发现将普通皮肤细胞转化为干细胞的方法，这样得到的干细胞称为诱导性多功能干细胞（inducedpluripotentstellcell，iPScell）。
iPS细胞具有和胚胎干细胞类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，因此在医疗领域的应用前景非常广阔。这种成体细胞“初始化”逆转为干细胞，无异于“返老还童”，这一新技术也被权威科学杂志《自然》《科学》分别评为今年第一大和第二大科学进展。
其次是“干细胞因子（stemcellfactor，SCF）”，是一个新近发现的细胞因子，首先在骨髓中被分离出，分子量为31000～36000，以非共价二聚体形式存在由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋白，是一种对造血细胞有重要作用的因子。它作用于最早阶段的造血细胞，对早期粒系、淋巴系、红系和巨噬细胞系均有刺激生长的作用，并且表现出对其他造血生长因子较强的协同作用。除恢复造血功能外，对于一些疾病如放化疗后造血机能的恢复，对于机体防御功能的调节以及辐射的防护方面均有良好效果。
第三是干细胞的局部及全身应用，许多个案表现出的惊人效果。采用大鼠亚急性衰老与普通衰老模型，ADSCs异体移植后，观察其对衰老模型大鼠体内自由基和免疫功能的影响。结果与空白对照组比较，模型组大鼠血清SOD、NO、IL-2水平及脾脏指数均显著性降低，血清MDA水平显著升高。
3.3ADSCs与组织工程
我国近年来对间充质干细胞的研究也极为重视，在国家863计划支持下，在组织工程肌腱构建技术、组织工程皮肤制备工艺、组织工程骨构建与材料结合、亚全能干细胞可塑性、干细胞分离纯化技术、新型血液调控因子、种子细胞扩增技术、神经损伤再生套管等项目均有明显的原始创新。
在种子细胞选择方面，通过对骨髓、皮肤、脂肪、软骨等来源的干细胞或体细胞进行筛选比较，确定了相关产品的优选种子细胞，并对其传代、培养、扩增、鉴定等技术进行优化。在材料选择、制孔技术、组织构建中的力学强度、制备工艺与相关设备、血液化组织工程骨等多项核心技术均有重大进展，对产品的研发起到至关重要的作用。
4展望
对iPS细胞的应用研究将成为今后几年重点趋势。我们应该清醒意识到，iPS细胞的研究将颠覆既往的干细胞研究方法，无瘢痕、年轻化、快速愈合都将成为简便的干细胞诱导性疗法，而ADSCs将有可能被称为iADSCs，成为iPS的主力军。此外对iPS细胞诱导方式的研究；对干细胞治疗浓度的研究；对组织工程生物材料及其血管化研究；临床干细胞应用研究都将展示人类美好的治疗前景。
参考文献
【关键词】细胞代谢代谢性疾病细胞代谢障碍
【中图分类号】G71【文献标识码】A【文章编号】2095-3089（2012）08-0204-01
要认识细胞和疾病的关系，首先要明确细胞是生命活动的基本单位。细胞作为功能与代谢的基本单位，其具有有秩序的、单独的通过自我控制的复杂代谢体系。在生物有机体进行的一切与生命活动相关的各项代谢活动与执行功能过程中，细胞就作为一个有秩序的、各个细胞独立的、自我控制能力很强的的代谢体系参与到有机体生命活动中。而细胞代谢又是细胞正常生长不可缺少的生命活动。因此细胞代谢与各种疾病的关系也是密不可分的。所以要想研究细胞和疾病的关系必须从细胞的生命活动当中去寻找，首先是细胞的新陈代谢，大约平均每过三个月人体细胞的结构就要更新一次，因而细胞能否正常代谢就决定了细胞更新后的结构是否完整。
疾病和细胞的关系还可以从细胞的结构上去研究，近年来的科学研究发现，人体内的细胞外基质的功能对生物学意义不仅表现在物理学性质和作用上，而且肿瘤的转移、人体的发育、细胞的损伤与修复、免疫应答以及在细胞的分化与移行信号的传导等生理过程和炎症等病理过程中具有重要的功能和作用，最近几年来，细胞外基质与各种临床疾病的关系已经成为各种生物学以及疾病研究的重点对象，细胞外基质的研究也作为细胞生物学与生物学研究的热点越来越受到人们的重视。
研究细胞代谢和疾病的关系也不能落下研究细胞的分化，细胞分化异常就会变成癌细胞，因此就会产生癌症这种骇人听闻的疾病，癌症相信大家都知道，我国每年死于癌症的就有200万人。最后，就像生物体一样，细胞也有衰老和死亡，因此细胞的衰老和死亡也是研究细胞代谢和疾病的关系的一个方面内容，细胞的衰老了就会使使细胞代谢活力下降，因此细胞的生存能力下降，很好理解，细胞生存能力下降，各种功能就不会满足生物体的正常生命活动，必然就会导致疾病，细胞的死亡使正常细胞结构消失、功能异常，也必然导致疾病。
代谢是生物体内一切用于维持生物体各项正常生命活动而进行的各种化学反应的总称。正是由于这些化学反应，生物体或者细胞才能够进行正常的繁殖和生存。代谢可以被认为是生物体不断进行物质和能量交换的过程，生物体的正常生命活动离不开细胞代谢，细胞代谢停止了，生物体内不能进行物质和能量的交换，有用的物质吸收不了，有害的物质排不出去，需要能量的地方没法传送能量，那么生物体的生命迹象就会停止，各种生命活动也会消失，就是我们说的死亡。婴幼儿、青少年正处在长身体过程中，所以在建造自身的机体的时候就需要更多的物质来维持，因此就是说年轻的生物体和细胞的新陈代谢旺盛，有用的物质能很快吸收，有害的物质能很快排除，因此就减少了疾病的发生，另外同化作用也占主导位置。这就是为什么年轻人不容易生病身体健康的原因。然而到了老年和晚年，人体机能渐渐开始退化，同化作用与异化作用都有所下降，细胞新陈代谢也就逐渐缓慢，就和年轻人不一样了，免疫力下降各种疾病就会随之而来。只要是正常的生命活动细胞新陈代谢就不会停止。例如动物的冬眠，虽然它们不进水不进食，但是细胞新陈代谢并未停止，只不过变得比平常的时候缓慢。新陈代谢是生命体不断进行自我更新的过程，如果细胞新陈代谢受到抑制，各种危害我们身体健康的不利因素也就随之而来。而其中最常见的就是代谢性疾病。
代谢性疾病即因代谢问题引起的疾病，包括代谢障碍和代谢旺盛等原因，主要包括以下这些疾病：1.糖尿病；2.糖尿病酮症酸中毒；3.高血糖高渗综合征；4.低血糖症；5.痛风；6.蛋白质-能量营养不良症；7.维生素A缺乏病；8.坏血病；9.维生素D缺乏病；10.骨质疏松症。
细胞代谢受到抑制通常也会引起退化性疾病，按照现在的说法，我们所知道的癌症和不育只是所有退化性疾病中的两种。其它的退化性疾病还包括老年痴呆症、糖尿病、心脏病、肥胖症、高血压、关节炎等等。人类只有一种疾病，那就是细胞代谢障碍或故障。细胞故障可以不同形式和不同程度出现，分布在不同部位，表现为不同症状。当所有细胞代谢正常时，人体处于健康状态。细胞出现代谢障碍有两个根本原因：细胞得不到它所需要的东西（营养不良），或者被它所不需要的东西伤害（毒素超载）。
除了环境突变或发生事故，疾病不会突然出现。生病是一个过程，只有当大量机体细胞（组织）出现故障时，才会在机体组织层面出现明显的病症，或有明显的感觉（不舒服）。例如，肥胖是机体细胞的脂代谢障碍，脂肪代谢障碍也叫脂肪重新分布，由于细胞代谢受到阻碍，你身体生产、利用和储存脂肪就会紊乱。而癌症则是机体细胞的氧代谢障碍。其实癌症并不神秘，由细胞中毒，导致“断迅、缺氧和糖化”产生。中毒使细胞通讯失灵，与免疫系统失去联系，变得毫无目的和不受限制。缺氧使细胞原始化，失去分工，开始像原始细胞那样繁殖。糖化提供了细胞在厌氧状态下复制繁殖所需要的营养。癌症病人通常有接触或摄入化学品、便秘、食欲下降和食用糖或淀粉的历史。2型糖尿病是细胞的糖代谢障碍，实际上是大量机体细胞对胰岛素敏感性的下降，其形成过程需要十到二十年的时间，最终才会出现口渴、饥饿、多尿、消瘦和高血糖。同样的道理，心脏病和癌症的形成通常也需要一二十年的时间。
当细胞被各种重金属、农药、药物或化学品入侵时，细胞核和DNA遗传信息可能就会受到污染而破坏，细胞膜的传送物质能力就会受到抑制，细胞间的通讯就会中断，物质无法传送，就会产生各种疾病。如果由于细胞间的通讯中断，自然细胞和免疫系统就不会产生联系，因此细胞处于原始状态的厌氧细胞在糖的无氧酵解中不受限制，可能发生毫无目的分裂和复制，就会产生癌变。
总而言之，细胞作为生物体的不可缺少的进行生命活动的个体，要想研究疾病就离不开对细胞的研究，疾病中的一切问题最后寻找到根一定是要从细胞中寻找原因。而细胞代谢又是研究各类疾病的有力途径。深入研究学习细胞代谢活动就会寻找出一切致病的原因，疾病的过程，治病的方法，防病的措施。所以对细胞代谢的深入研究一定会找到解决各种疑难杂症的方法，这种研究必将造福全人类。
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关键词：教学模式改革；细胞生物学；体系构建；课程
中图分类号：G62
文献标识码：A文章编号：16749944（2017）09023203
1引言
细胞生物学是支持生命科学与技术发展的基础学科之一[1，2]，也是高校生物类各专业的课程体系中具有重要地位的一门专业课程[3]。近年来，随着生命科学领域的快速发展，细胞生物学的研究成果层出不穷，知识体系不断更新，对高校细胞生物学课程的教学形成了极大的挑战。另外，细胞生物学理论性强，内容抽象，学生缺乏感官认识，提不起兴趣，课堂效果不佳[4，5]。笔者从细胞生物学的课程特点出发，阐述了对细胞生物学课程课堂教学的改革思路与相关思考，以期能为细胞生物学教学改革提供有益参考。
2细胞生物学课程教学改革的必要性
细胞生物学课程教学以真核细胞结构、功能和生活史为主要内容，强调细胞是生命活动的基本单位，突出生物膜，细胞信号转导，细胞增殖调控，细胞分化、衰老与凋亡，肿瘤生物学等热点问题，使学生通过本课程的学习，了解和掌握真核细胞的结构与功能，并深入理解彼此之间的相关性和一致性，从显微水平、超微水平和分子水平等3个层次认识细胞生命活动的本质和基本规律。细胞生物学课程内容与生物学其他学科相互联系、相互渗透，涉及到植物生物学、动物生物学、生物化学、遗传学、分子生物学、生理学等诸多学科，就知识内容方面而言，细胞生物学与其他课程存在一定重复。
细胞生物学是生命科学领域发展最快的学科之一。随着知识的更新速度不断加快，细胞生物学课程的信息量也呈现较快增长态势。而当前教学改革的趋势是压缩学时和学分，从这个意义上讲，教师必须更新教学内容，同时也要对教学重点进行适当调整以适应学科发展的需要。对于新建本科院校来讲，由于学科背景薄弱、专业发展水平较低以及师资条件较差等因素的限制，教师要想在较短的时间内提高细胞生物学课程教学效果，难度更是可想而知。此外，现有的专业人才培养方案和教学计划，在课程内容体系上与先行课程及后续课程也有一定的重复，导致有限的学时分配不合理，难以突出学科的特色和重点。
3细胞生物学教学改革探索
3.1教学内容的选择与体系构建
课程教学内容体系是学生基本知识结构和基本能力形成的基础和关键。因此，教学内容的新颖与否对提高教学质量有显著影响[2]。为突出细胞生物学的学科特点，教学过程中应对授课内容的选择及基本知识体系的构建给予足够的重视，重点突出细胞生物学中有学科特色的内容，而对于其他学科内容重复的部分，应点到为止，少讲或不讲。如果有学生对部分内容存疑，可以组织答疑活动。如本课程中细胞膜的结构模型、化学成分中生物大分子的基础知识、细胞组分定性分析及离心分离等内容，在中学生物以及生物化学等课程中有较为详细的讲解，所以在本课程的教学过程不应该花太多的时间。而对于各种细胞器的结构与功能等相关内容，是细胞生物学基本知识体系的核心，应在中学生物或其他课程的基础上，进一步深入细致地学习。对于细胞信号转导和基本生命活动过程（增殖、分化、衰老和死亡）调控机制的研究，是细胞生物学近些年的研究热点，新成果层出不穷，所以应在课堂教学中作为重点来学习，鼓励学生去阅读相关文献，接触细胞生物学研究的前沿，感受学科发展中最激动人心的部分，激发学生的学习兴趣。
在现代生命科学迅速发展的背景下，细胞生物学学科内容也日新月异，作为生物类专业的核心课程，其课程内容体系不是一成不变的，课程教学内容体系的构建和更新速率必须与基础科学的发展同步。作为一名大学老师，也要树立终身教育的思想，始终把握前沿知识，根据近年来学科的发展动态，在原有教学体系的基础上，逐步调整教学内容的重点和难点。课余时间多阅读各类专业文献，力求把这一领域的最新研究成果和关键问题融入到教学内容中去。要构建科学完善的课程内容体系，既要考虑学生的实际情况，又要考虑到现有的教学条件。这就要求教师在备课的时候，在把握主要的教学参考书的基础上，增加课外知识，一方面开阔自己和学生的视野，完善学科教学的知识体系，另一方面可以进一步激发学生的学习兴趣，保证课堂学习的效果。根据多年的教学实践经验，笔者认为，细胞生物学课程教学遵循的基本原则应该是：力求使本学科和其他课程的知识紧密联系，避免不必要的重复，在有限的教学时间内，将最有效的信息传输给学生知识。切身的改革实践表明，各门课程的综合考虑，以及相关内容教学方法的整体协调，既能保持细胞生物学课程知识内容的独立性、完整性和系统性，也可以解决相关课程内容之间的重复问题，提高教学效率和实际效果，激发学生的学习兴趣。
对于细胞生物学实验的教学，应增加基础性、设计性和综合性实验，以培养和发展学生的基本实践能力。此外，可以让学生参与自己的科学研究课题，或者参加国家大学生创新训练项目，接受系统的试验技能训练，进一步提高学生的专业能力水平。
3.2教学模式的优化
3.2.1科学运用多种教学媒体，做好课堂教学
因细胞生物学主要讲授细胞的结构、功能、信号转导和细胞增殖、生长、分化、衰老、凋亡等生命活动及其调控机制，而要将诸多繁杂的知识较为直观有效地传授给学生，必须要有大量图片或模型作为辅助。因此，细胞生物学课堂教学应采用多媒体教学，精心设计和科学使用高质量的课件，并辅以必要的板书以及其他教学媒介，使课堂教学图文并茂、生动形象，这样才能最大程度吸引学生注意力，激发学生学习兴趣，保证课堂教学效果。北京大学翟中和院士主编的最新一版的细胞生物学教材已改为彩版，并附大量精美图片，为多媒体教学提供了很好的素材。教师在课堂教学过程中，还需要借鉴国外教材的内容体系、图像数据和动画片段，才能更好地发挥多媒体教学的优势。
3.2.2C合运用启发式教学、案例教学和问题教学法
当代大学生个性较强，思维活跃，每个学生都有自己特点，他们对教师教学方法的要求不尽相同。在课堂教学中，讲授法虽能在较短的时间内，有计划、有目的地传授给学生较多的知识信息，但由于师生互动的缺乏，教学效果不太理想。启发式教学和案例教学模式能够更好地调动学生的学习主动性，培养其独立思考和自主解决问题的能力，应积极应用到课堂教学中去。如在备课过程中准备一些启发式问题，并在上课的时候适时提出来，不仅有助于培养学生的思考能力，而且能够有效地提高学生的学习效率与和对学科内容的掌握水平；通过讲解一些具体的细胞生物学研究案例，能够使学生直观了解并深刻记忆具体的专业知识，同时还能增加学生对学科发展历史的了解。此外，问题教学法在专业课教学中也是一个比较有效的方法，也适合应用于细胞生物学课堂教学和实验教学中[6]。
3.2.3准确把握学生动态，增强教学的针对性和目的性
教师应采取多种形式和渠道，了解学生的学习状况，听取学生对课堂教学各方面的反馈意见，并及时调整教学进度、教学内容、教学方法，这是提高课堂教学质量的关键。当前国内高校，尤其是地方本科院校，普遍存在学生学习兴趣缺乏、主动学习能力较差的情况，所以教师尤其应该关注每个学生，了解他们的实际情况，并与之建立良好的互动关系，才能逐步提高学生的课程学习效果。
3.3考核方式与内容的改革
细胞生物学是生物类各专业的必修课程，当前一般采取期末闭卷笔试结合平时作业的方式进行考核，部分高校还增加了期中考试，但总的来说期末考核的权重还是偏高，基本属于终结性评价方式。在教学实践中，应适当引进过程性评价方式，对学生的考核采取学习目标和学习过程并重的价值取向，对学习效果、学习过程和其他与学习相关的非智力因素等进行综合评价。
考核内容与具体要求应与高等教育的发展相适应，理论联系实际，进行科学合理的命题，增加应用性题目的比重，避免出现过多简单记忆性题目。我校近年来对考试命题工作提出了愈加细致的要求，尤其是对综合应用性题目所占比重有了具体数量的要求，这为细胞生物学考核方式改革指明了方向。同时，在这样一个生物科技快速发展的时代，也应适当加强对学生把握学科进展与发展趋势能力的考核，如每年度的诺贝尔生理学或医学奖以及诺贝尔化学奖等方面的内容也可以纳入考核内容体系中。
4教学改革的初步成效
课程建设是不断提高教学质量的重要途径和基本保证。因此，在细胞生物学课程教学中，应不断积累经验，积极加强课程建设。随着我校对课程建设和课堂教学改革的不断深化，细胞生物学申报了滨州学院校级重点课程、双语课程、核心课程等并均成功获批立项。经过几年来的努力，课程建设水平和教学团队整体能力均有了大的提升。细胞生物学教学团队着重从开放式教学和培养学生创新能力入手，积极探索开放式教学的新模，并尝试构建形成立体化教材体系，即以细胞生物学主教材（北京大学翟中和院士等主编）为核心，组织人员从不同角度、不同层次编写辅助教材，做到既有纸质教材，又有电子与网络资源，辅以购置的视频资料，从而形成了多层次、立体型的教材体系。最后，还应注重加强细胞生物学课程的课程档案建设以及课程评价体系的构建，进而从根本上保证教学改革的成效与可持续发展。
5结语
随着人类基因组计划的完成，克隆技术、细胞工程、转基因技术等领域的飞速发展，细胞生物学正处于一个快速发展的新阶段[7]。作为新建本科院校，在其应用型人才培养目标导向下，细胞生物学课程教学目标也应以培养学生运用各种学习手段提出问题和分析解决问题的能力为主，让学生将所学到的细胞生物学的理论知识与具体实践活动结合起来，以提高他们的动手能力[6]。总之，教学改革是一项系统工程，需要学校、教师、学生多方面共同参与才能取得理想的效果。
参考文献：
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关键词：细胞生物学；教学改革；教学内容；教学方法
中图分类号G642.0文献标识码A文章编号1007-7731（2013）18-137-03
细胞生物学是从显微水平、超微水平和分子水平等不同层次研究细胞的结构、功能以及生命活动的一门科学，反映了现代生命科学的发展趋势，已成为高等教育中生物学、农学、医学等相关专业的一门必修课，并与植物学、动物学及微生物学等多门学科相互联系、相互渗透[1]。当前，随着生命科学的快速发展，细胞生物学教学在新的历史时期面临着前所未有的机遇和挑战。传统的单一教学模式忽视了启发式教学，束缚了学生的思维和个性的发展，并且教材中的知识点明显滞后，教学内容不够完善，不能针对不同专业和学科需求进行选择性教学。为适应新形势下人才培养的需求，必须改变传统的教学模式，适时更新教学内容，提高教学效率。
为此，本文从《细胞生物学》的课程特点着手，着重阐述了如何优化《细胞生物学》课程的教学内容，合理地运用不同的教学手段，结合多种成绩考核方式，使学生在有限的学时内能够较为系统地掌握本学科的基础知识，了解细胞生物学的发展动态和研究进展，充分调动学生学习的积极性，提高《细胞生物学》的教学质量。
1建设过硬的教学团队
细胞生物学是一门实践性和前沿性较强的学科，要提高教学质量，首要的是建立一支经验丰富和理论知识过硬的教学团队[2]。针对安徽农业大学的学科定位及师资特点，教学中应以资深老教师为核心，培养一批理论和实践知识较扎实且具有一定创新能力的年轻教师作为支撑力量，不断完善教学内容，丰富教学方法。任课教师不仅需要熟悉教学内容，而且要能系统地把握教材的主线，将不同章节的知识点串联起来，摒弃其它学科中重复的知识点，真正做到教学点突出。同时，根据不同的专业特征制订出合理的教学计划，从各个教学环节上逐步提升教师的教学水平。任课教师还应注重跟踪本学科前沿领域新的理论和新的技术，实时更新自己的教学内容，积极与本课题组其他教师进行教学经验和教学技能的交流与改进，不断提升教学水平。
2优化教学内容
教师应结合本学科专业设置及学生对相关领域基础知识的掌握情况，选择合适且具有代表性的优秀教材作为蓝本。考虑到安徽农业大学的学科建设特征，本课题组选用了翟中和主编的《细胞生物学》（第四版）作为主要教材，同时参考王金发教授主编的版本进行相关知识点的补充。为弥补教材不能实时更新的缺陷，还要将国外一些著名教材和细胞生物学相关网站介绍给学生。在较系统地阐述细胞生物学教学基础内容的同时，力求把该领域的最新科研成果和热点内容融入到教学中，从而激发学生渴求新知识的热情和动力。
其次，随着生命科学的快速发展，细胞生物学与生物化学、遗传学、分子生物学等学科的教学内容相互交叉，这就要求教师在授课时应根据实际情况进行选择性教学，突出本学科和专业特有的内容，避免繁冗的章节被重复讲授。例如细胞通讯、细胞骨架及细胞大分子等基础知识是细胞生物学中不可缺少的组成部分，而对蛋白质的生物合成和修饰等内容在生物化学中已有详细阐述。与此相类似的，染色体结构特征及核型分析主要在遗传学中已讲授，而基因表达调控和转录后翻译等是分子生物学的主要内容。教师在讲授时应力求知识点的相互串联，通过启发式教学，使得学生对整个知识能系统把握，起到温故而知新的效果，避免不必要的重复。实践证明，这种承前启后的教学方式，既保持了《细胞生物学》课程的完整性、系统性，又解决了相关课程间的重复教学问题，对提高单位时间内的教学效果，激发学生的学习兴趣具有积极作用。
除此之外，每年还应根据本学科最新的发展动态实时调整教学内容及授课的重点、难点，不断提高和改进教学方法，丰富教学内容，开拓学生视野。
3不断改进教学方法
3.1充分体现学生的主体地位传统的教学方法过于注重教师的教授，而忽视了学生的互动。然而，教与学是统一的过程，教师在教学中起主导作用，而学生是学习的主体，二者是相辅相成的。教师在讲课时可结合运用设疑启发式教学方法，打破“满堂灌”的教学模式，充分调动学生的积极性，发挥其主体地位作用。通过讲解一系列经典有趣的实验，将讨论融入到课堂教学中，指导学生查阅相关文献并展开讨论，充分发挥学生的主观能动性。同时，通过一些教学手段调动学生积极参与教学过程，引导学生主动学习，培养他们的发散思维能力。例如，教师在讲述某一新发现或新知识点时，可先依据已学的内容，指导他们通过网络查询和图书馆丰富的图书资源获得相关知识，变封闭式学习为开放式学习，鼓励学生各抒己见，营造和谐、宽松的学习气氛，注重培养学生研究性学习的兴趣和能力，增强学生参与知识获取的积极性和自觉性[3]。
3.2传统教学方法与多媒体教学手段并举随着电子信息技术的快速发展，多媒体技术为《细胞生物学》教学提供了强有力的手段，用它独特的优势有效地推动了教育信息化进程，对突破传统的教学思想和组织形式带来了深刻的影响。多媒体教学内容丰富、图片清楚形象，使复杂和抽象的微观世界变得更加直观，特别是把显微镜拍摄的图像展示出来，有利于学生对本学科知识的直观理解。同时，在实践教学过程中，教师也可借鉴国内外优秀教材中的知识点及学科最新发展动态，将一些研究结果和抽象的知识点通过相关软件制作成动画效果，便于学生的形象记忆和理解。例如，物质的跨膜运输、信号转导及蛋白质筛选机制等。虽然多媒体已成功地运用到实践教学中，且具备众多优势，但任课教师应根据课程特点，明确多媒体的辅助教学地位，结合传统教学手段，充分发挥教师在课堂上的主导作用，以求达到最佳的教学效果。
Blackboard网络也是一个与同学有效互动的的教学平台，教师可将本学科的教学计划、教学课件及参考资料等通过该网络平台展示给学生，课后与同学建立问答学习模式，拓展了学生学习的空间，有利于学生对不同的知识点进行比较、分析及归纳演绎等思维活动的进行。与此同时，教师的角色也从原来的知识传授者，向教育和教学的设计者和管理者的方向转变。实践证明，现代教育信息技术有利于激发学生的思维能力和应变能力，使学生从不同侧面、不同层次运用不同思考方法来分析问题、解决问题，有效地提高了教学质量和教学效果。
3.3注重双语教学双语教学是借助于两种语言对相关领域的知识进行传播和交流，已成为推动我国高等教育国际化的重要举措，自2001年起教育部先后出台的双语教学相关文件中，明确指出高校20%的本科课程应进行双语教学[4]。这是我国高等教育与国际接轨的必然趋势，更是培养高层次人才的迫切要求。针对细胞生物学的学科特征，一些新知识、新技术及新学说几乎都以英语方式传播，为将这些前沿知识引入高等院校《细胞生物学》的课堂教学，开展以英语为主的双语教学就显得十分必要。其次，SCI（ScienceCitationIndex）收录的期刊文章70%以上采用英文撰写，尤其是生命科学研究的前沿领域，双语教学可改进和提高教师和学生的英语水平，为进一步学习和交流打下良好的基础。这就要求学生在掌握细胞生物学基本知识的同时，还要熟悉常用的英语专业词汇及表达，不断提高使用专业英语的综合能力。
在我国生命科学科研水平较为落后的情况下，要获得前沿知识主要依靠查阅相关文献，而且国内大多数细胞生物学教材的一些知识点也主要来自英文原版教材的翻译和修订，这不可避免的导致知识滞后及一些新专业术语直译所造成的模糊等问题。利用双语教学不仅可以引导学生直接阅读英文原版教材及查阅相关英文资料，及时掌握细胞生物学的最新研究进展，锻炼学生的思维，开拓学生的视野，增强学生的就业竞争力和出国学习深造能力，培养外向型人才。
4多种成绩考核方式并用
成绩考核是为了检验教学效果，督促学生学习的方法之一，它贯穿课程学习的整个过程。当前，闭卷考试仍是考核的主要方式，主要集中对学生学习掌握书本理论知识情况进行检测，而对于学生分析问题和解决问题的能力考核涉及较少，忽视了学生创新意识和创新能力的开发和评价。为培养多层次人才，教师应结合传统的课程考核方式建立一种多种考核方式并用的评价模式。依据不同专业的教学大纲，选择相应的试题库作为学生复习的模板，保证学生有目的、系统性地对所学的内容进行认真复习。为督促学生对本学科前沿领域知识的把握，教师可在课程进行到最后几周时，布置一些细胞生物学研究热点的题目，以小组为单位，组织学生进行学习讨论与探索，采用幻灯进行汇报讲解，最后根据汇报质量评定成绩。这是西方知名院校教学中常采用的一种重要的教学模式，重在培养学生发现问题、解决问题的能力，是一种值得关注的研究性教学模式，有效地调动学生学习的积极性，有利于学生和对本学科前沿知识的掌握。
传统的考核方式仍然需要，首先仍需注重细胞生物学基础知识、基本理论及基本实验技能的考核评价，以名词解释、填空、选择、判断和简答为主。其次，可依据平时的教学内容和研究进展，设置若干道灵活性和系统性较强的综合性试题，学生可根据自己的专业特征进行选择性答题，此种方法可有效地评价学生解决问题的能力。细胞生物学作为实践性较强学科之一，不仅要求学生有扎实的理论基础，而且要具备熟练的实验操作技能，因此在考核的过程中，也要评价学生在平时实验操作中的动手能力。这种综合的考核方式既可提高学生学习《细胞生物学》的积极性，也使学生能够真正掌握《细胞生物学》的知识要点。
5结语
总之，教师在《细胞生物学》教学实践中，要结合实际情况勇于改革探索与创新，根据学生的专业特点及学科发展的要求，对传统《细胞生物学》教学的各方面进行合理调整和优化，秉承“授之以鱼，不如授之以渔”的教育理念，不断更新教学内容、改进教学方法和评价手段，实时把握学科研究的前沿动态，通过科研来指导教学，不断提高自身的业务能力和优化《细胞生物学》教学方法。
参考文献
[1]翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学[M].4版.北京：高等教育出版社，2011.
[2]王金发，何炎明，戚康标，等，细胞生物学与遗传学研究性教学团队建设[J].中国大学教学，2008，11：41-43.
下午好！首先感谢岑芳老师给我这样一个和大家交流、切磋的机会。这节课是我今年6月份在市电教馆录制的一堂新课程标准的探究课。当时接到岑老师给我的这个任务时，我非常高兴，但又很紧张。高兴的是我有这样一个机会展示自己，紧张的是因为我一直以来从事初中教学，2005年9月才开始上高中课，还是个新手，当时，我也只是接触了必修一的教学（因为我们学校第二学期才开课）。静下心来分析了一下岑老师为什么让我开课呢？我可能有自己的两点优势：一是我已经经历了3年的初中新课程改革，观念可以说已更新了不少，新课程的理念已融入课堂教学过程中。二是对初中新课程改革教材的熟悉，能帮助我在课堂教学过程中有效地关注学生的已有知识，做好初高中的衔接。高中的新课程改革是继初中新课程改革之后开始的，从知识内容上看，初高中知识必然存在着一定衔接，所以在课堂教学过程中应关注学生的初中知识背景，帮助学生通过知识的自然铺垫来自主构建高中的知识体系。
有了信心，我开始选择课题。新教材中有不少课都安排了“边学过做”的环节，有探究实验穿插的课，学生能动手活动，课堂气氛就容易活跃，比较热闹，能很好体现新课程理念，但要准备实验器材摄制录相课，来回搬运很费事，所以就从另一个角度来考虑，那就上一节思维探究的课。我想这样的课对于我们所有教师来说，都是可操作的。如果说初中的教学注重学生的小实验探究，那么高中的教学则更应注重学生的思维发展。记得在一次雨花中学的教研活动中，听了有关“生物课堂教学中渗透探究理念”的讲座，我深刻认识到在学习中可以通过多种形式体验科学探究过程。可以通过科学史、可以借助教师提供的资料、可以利用模型、还可以根据教师提出的问题进行讨论，只要促进学生的思维活动，就具有探究性。甚至，在极端的情况下，即使是教师一个人演独角戏，也能让学生对科学探究有所体会。关键是教师要把自己扮成学习者的角色，并且要剖析自己，把自己的思维过程展示给学生。这样我选择了必修一第三章第二节《细胞的类型和结构》。在座的每一位老师都已上过了这一节课，大家设计的肯定更为精采，希望多提宝贵意见。下面就我的备课思路向各位做一个汇报。
一、教材分析：
“细胞的类型和结构”是第三章细胞的结构和功能的重点内容，包括原核细胞和真核细胞、细胞膜和细胞壁、细胞质和细胞器以及细胞核四块内容，我选择了第1课时，内容涉及原核细胞、真核细胞和细胞膜。其中的细胞膜结构的知识与下一节“物质的跨膜运输”内容有着直接联系。
二、学情分析：
本课时出现的许多知识，如动、植物细胞的显微结构、染色体由DNA和蛋白质组成、哺乳动物的成熟红细胞没有细胞核、抗原和抗体能特异性结合等，学生在初中阶段的学习过程中已经涉及，因此在教学设计中要特别注意初、高中知识的自然衔接。高一的学生已具备一定的观察、比较、分析以及整合、利用信息的能力，作为教师应创设探究的情境，激发学生的智力参与，培养学生思维的深刻性、独创性。
三、教学策略：
新课程理念告诉我们，课堂教学过程，不只是教师向学生传递知识的过程，更应是教师向学生提供学习环境和经验，组织、指导和参与学生学习的过程，是学生主动学习、自主构建的过程。因此本节课的教学策略是：在课堂教学过程中注意设计巧妙的学习探究情境，给予丰富的资料信息，组织、指导和参与学生学习的过程。引导学生自主建构知识，充分发挥学生的主体精神，真正培养学生具有自主性的学习品质。
四、教学目标：
作为教师我们绝不能只做一个科学结论的摘录者，而应为学生的探究性学习提供丰富的素材，引导学生探索科学的奥秘，让学生不仅了解科学的结论，也了解科学的过程；不仅学习科学知识，还能发展能力，培养爱科学的情感和科学的世界观，从而实现全面提高科学素养的课程目标。为此制定了本节课的三维教学目标：
知识性目标：
1．区别原核细胞与真核细胞。
2．概述细胞膜的分子结构和主要功能。
技能性目标：
1．尝试一步一步地分析科学家的实验和结论，亲历科学家探索的历程，从而切身感受科学的魅力，并加深对科学过程和方法的理解。
2．利用教师提供的课外知识背景扩大知识面，开发思维空间，培养发散思维。
情感性目标：
1．探讨细胞膜结构的发现史，认同科学技术发展的日新月异，激发探求生命科学奥秘的兴趣。
2．确立生物体结构与功能相统一、相适应的生物学观点。
五、教学设计：
对本节课的几个知识点我是这样处理的：
（一）显微结构和亚显微结构的概念：只需要分别提供初中课本和高中课本上的上的动、植物细胞结构模式图让学生比较就可以了。因为学生能结合图的复杂程度和书上的概念，很容易理解什么是亚显微结构。
（二）原核细胞与真核细胞的区别：学生提到细胞的结构，就能说出细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核，所以我直接告诉他们这样的一类细胞称为真核细胞，真核细胞构成的生物是真核生物。但生物界还有另外一类细胞却很特殊，我们把它称之为原核细胞，原核细胞构成的生物是原核生物。继而质疑：原核细胞和真核细胞究竟有什么不同呢？然后给学生以提示：顾名思义，从字面上分析这两类生物的最主要区别在哪里？学生从“核”字上发现最主要区别在细胞核。这时再继续质疑：这两类细胞的“核”到底有什么区别呢？原核、真核细胞还有哪些区别呢？学生带着问题阅读课本的文字和图片资料很容易找到答案，所以让学生直接回答意义不大。因此我又设计了一个问题串：1．细胞核和拟核在结构上有什么不同？2．拟核的成分是什么？与真核细胞的染色体有什么不同？3．你认为原核细胞的结构简单，还是真核细胞的结构简单？为什么？引导学生分别从核膜的有无，染色体的有无，细胞器的复杂程度来对原核细胞和真核细胞作出比较。从而有效地培养学生的观察、识图、辨认、比较的能力。最后采取图表归纳法引导生进行归纳和总结，培养信息的整合能力。
（三）细胞膜化学组成：细胞膜化学成分的研究方法教材中并未介绍，但考虑到生物学是一门实验科学，从一开始就让学生体会科学的实验方法很重要，所以补充设计了一个小探究，引导学生思考选择哪种材料进行细胞膜的制备。这一点是借鉴了人教版的教材。
探究问题：如果给你以下材料：植物叶片、猪肝、哺乳动物的血液,你会选择哪种材料制备细胞膜？为什么？根据什么原理来做呢？
学生通过讨论交流认为应选择猪肝和哺乳动物的血液，因为植物细胞有细胞壁，不易分离出细胞膜，而动物细胞没有细胞壁，易分离出细胞膜。方法是让细胞内的物质流出来，就可以得到细胞膜了。可以用针扎破细胞，但学生又质疑：细胞太小了，这方法不太可行。
这时引导学生思考：细胞内的物质是有一定浓度的，如果把细胞放在清水里，出现什么状况？学生回忆初中学习过的有关细胞吸水和失水的知识，能说出水会进入细胞，把细胞涨破，细胞内的物质流出来，这样就可以得到细胞膜了。
教师再质疑这样得到的细胞膜是否纯净呢？实际上，刚才在比较原核细胞与真核细胞时同学们已认识到在细胞内存在着许多以膜为基础的结构，即细胞器。因此能够理解细胞除了细胞膜外，细胞核和许多细胞器也有膜，这些膜会与细胞膜混在一起，影响对细胞膜的研究，怎样把细胞膜与其他膜分离开？这样的分离肯定不容易，那我们换个角度思考，能不能从材料的选择上想办法呢？请同学们再分析刚才提供的三种材料，猪肝、哺乳动物的血液，你发现了什么？学生联系初中学习过的知识：血液中成熟的红细胞没有细胞核，不存在核膜。老师再补充有关知识：哺乳动物成熟的红细胞中也没有众多的细胞器，不存在细胞器膜。这时学生恍然大悟，得出结论：用哺乳动物的红细胞作实验材料，可以制备得到较纯净的细胞膜。
老师再做介绍：把红细胞放入蒸馏水中，细胞肿涨，最后破裂释放出内容物，主要是血红蛋白和无机盐，留下一个保持原形的空壳，称为血影，即红细胞的细胞膜。然后利用血影进行化学分析。通过这个小探究实验，学生不仅学会了探究的方法，体验实验材料的正确选择对于科学研究的重要性，而且进行了科学思维方法的训练，体会到制备细胞膜的方法中所蕴涵的科学原理。
（四）细胞膜的结构和特点：这是本节课的重点，如果采用讲授法直接告诉学生，学生会觉得很干巴，感到枯燥无味，很难产生学习的兴趣，这样又会走上死记硬背的老路。因此在这一部分的教学过程中，考虑设计两个探究情境，以问题串的形式，分析科学家探索生物膜结构的曲折历程。
情境1.资料探究——回顾细胞膜结构的发现史，向学生提供3个科学实验过程：
实验一：1885年，奥弗顿在研究各种未受精卵细胞的透性时，发现脂溶性物质容易透过细胞膜，不溶于脂质的物质透过细胞膜十分缓慢。
实验二：1925年两位荷兰科学家用丙酮从人的红细胞膜中提取脂质，在空气－－水界面上铺展成单层分子，测得单分子层的面积恰为红细胞表面积的2倍。
实验三：Danielli和Harvey分别于1931年和1935年发现细胞膜的表面张力显著低于油水界面的表面张力，已知脂滴表面如吸附有蛋白质成分时，表面张力则降低。
设置讨论题：由这些实验，你能推测出什么结论？请同学们进行小组讨论和全班交流。学生在一步一步地分析科学家的实验和结论的同时，亲历了科学家的探究历程，从而切身感受科学的魅力，并加深对科学过程和方法的理解。
实验一：推测细胞膜由脂质物质组成。（相似相溶的原理）
实验二：推测细胞膜由双层脂质分子组成。
实验三：推测膜中含有蛋白质。
在教学过程中，我发现学生对实验二的推测有一定的困难，因此配了简图并告诉学生：科学家经过大量实验发现，脂质中的磷脂是细胞膜主要成分。磷脂分子的结构在前一章“生物大分子”中已介绍过，书上有其模式图，因此可以向学生解释：磷脂分子的“头部”亲水，所以在水——空气界面上磷脂分子是“头部”向下与水面接触，尾部则朝向空气一面，这样测得单分子层的面积恰为红细胞表面积的2倍。
学生通过这样的资料探究，自主构建了细胞膜的化学成分——脂质和蛋白质，其中磷脂是双分子层。
情境2.实验探究——利用“人的细胞和鼠的细胞为什么能融合”的积极思维活动，引导学生说出细胞膜的结构特点。书上对“人、鼠细胞融合实验”的提供了实验步骤，先让学生自学，希望他们提出阅读中不理解的地方。这个实验理解的关键是人和小鼠的细胞表面为什么能标记上红、绿色的荧光素，同样涉及了初中免疫一章中有关抗体和抗原相结合的知识。因此向学生解释：在细胞膜上存在着一些抗原物质，用荧光素直接标记抗原比较困难，因此可以先标记抗体，根据抗体能够与抗原相结合的特点，使标记变得容易，这样在人和鼠的细胞膜表面上就呈现出了红、绿荧光素。
学生观察实验现象发现细胞膜中的抗原蛋白又重新分布了，于是总结出细胞膜中的蛋白质是可以运动的。
但如果就此结束这段教学还有点遗憾，因为细胞膜的主要成分是磷脂和蛋白质，所以我继续设疑：细胞膜的其他成分是否可以运动呢？向学生提供了一个图片资料：磷脂分子的运动方式图解，并向学生提供数据：磷脂分子的两链转速达1016次/秒，磷脂分子与周围分子互换达106次/秒。学生感性地认识到磷脂分子也是可以运动的。从而得出最终结论：细胞膜的磷脂分子和蛋白质分子大多数是可以运动的，即细胞膜具有一定的流动性。
课进行到这里，学生已对细胞膜的化学成分、构及特点已有了充分的认识，在此基础上，再利用细胞结构分层模式图对细胞膜的结构进行总结，水道渠成。用一个模式图解分步骤演示，请学生自己总结。
在观察细胞膜结构图片时，学生发现了细胞膜上还有糖蛋白。糖蛋白的识别作用则引用一段小资料：取两种不同的海绵动物，使其细胞分散成单个的，然后将这些细胞掺在一起混合培养，发现只有同种的细胞才能结合。后来对细胞表面的糖蛋白进行分析，结果表明，这两种海绵细胞表面糖蛋白的氨基酸成分相同，而糖类的成分不同。说明动物细胞表面糖蛋白具有识别作用，好比是细胞与细胞之间，或者细胞与其他大分子之间，互相联络用的文字或语言。对一些介绍性的内容，我尽量向学生提供资料，这样可以使学生们在接受知识的同时感受到任何一个结论性的内容都离不开科学的实验、观察，都是建立在事实的基础上。
以上两个探究性情境以问题串的形式联系在一起，引导学生在不断的分析、质疑、总结的过程中自然而然接受了知识，自主构建了细胞膜分子结构和特点的知识体系，并且加深对科学过程和方法的理解。
（五）细胞膜的功能：对于细胞膜的功能则采取学生自由讨论交流的形式，引导学生从膜是细胞的边界的角度考虑，在初中已有的知识的基础上，学生能说出保护、控制物质进出的作用，从而认识到由于细胞膜的存在，使细胞既是一个“封闭”系统，又是一个“开放”系统。对于细胞膜控制物质进出细胞的功能，点到为止，不要展开叙述，避免与下一节物质的跨膜运输重复。信息交流是细胞膜的一个重要功能，提供图文资料，帮助学生了解。至于其他功能，则以开放的处理方式，鼓励有兴趣的学生自己去探究。
（六）课后延伸：课后安排一个资料收集活动，要求学生根据已有的生物知识或生活经验，寻找可以证明细胞膜具有流动性的证据。给予提示：细胞膜具有流动性，必然体现在膜的形状变化或其上分子的运动。
例：1．白细胞吞噬细菌和过程，变形虫的伪足运动现象。
2．受精时细胞的融合过程。
3．动物细胞分裂时细胞膜的缢裂过程。
通过这样的活动让知识从课堂延伸到课外，培养学生的资料收集能力，更培养了发散性思维和知识迁移的能力。
六、课堂艺术性的体现
教学是一门艺术，怎样才能让自己的课堂教学自然流畅？我觉得知识点之间的转接语言处理很重要。在日常的上课过程中，我们可能经常用这样一些语句“首先介绍一下细胞膜的化学成分”，“接下来我们一起来学习有关细胞膜的结构”，“下面研究一下细胞膜的结构特点”等做连接语生硬地把知识点之间的教学联系起来。在这一堂课中，我对教学的串词有意识地进行了设计。
在原核细胞与真核细胞的比较之后，如何过渡到细胞膜的教学？做了这样一段引入：不论是真核细胞还是原核细胞，细胞虽然很微小，但是却有非常精细的结构和复杂的自控功能，这些就是细胞之所以能够进行一切生命活动的基础。下面就让我们一起走进细胞。任何系统都有边界。一个国家有陆地、海域、领空的边界；人体内部与外界分隔开的皮肤和黏膜，是人体的边界。边界对系统的稳态至关重要。细胞作为一个基本的生命系统，它的边界就是细胞膜。
在细胞膜化学成分探究完成后，如何进入到其特点的研究？
我利用了一张图片，进行介绍：由于细胞膜很薄，而光学显微镜的分辨力低，因此在光学显微镜下是看不清细胞膜的。直到20世纪50年代，电子显微镜诞生，在电镜下真正看到一层厚约8nm的膜。1959年，罗伯特森在电镜下看到了细胞膜显示出清晰的暗—亮—暗的三层结构，中间的亮层是脂质分子，两边的暗层是蛋白质分子，于是他大胆提出生物膜的模型：所有的生物膜都由蛋白质—脂质—蛋白质三层结构构成，并把生物膜描述为静态的统一结构。20世纪60年代以后，不少科学家对细胞膜是静态的观点提出了质疑。相信同学们看了以下的现象，你也会怀疑。
播放吞噬细胞的作用FLASH，血液中的吞噬细胞通过变形作用出毛细血管的管壁，到达病菌聚集的地方吞噬病菌，细胞怎么会变形，又怎样吞噬病菌，这一现象用细胞膜的静态观点可以解释吗？显然不好解释。这样顺理成章提出下面研究的问题：有什么证据可以证明细胞膜中的物质是不断运动的呢？从而引出积极思维活动：“人细胞与鼠细胞为什么能融合？”
【关键词】中药；血管内皮细胞；保护
近年来研究表明:血管内皮细胞是人体最大的、高度特化的、功能异常活跃的内分泌、旁分泌及代谢器官,可以分泌几十种活性物质,并摄取、转化或灭活血液循环中或局部产生的多种活性递质,在创伤修复、血管生成、止血、血栓形成、出血性疾病、动脉粥样硬化和糖尿病等一系列生理病理过程中行使着重要的调节功能。
1血管内皮细胞的损伤与常见的心血管疾病
血管内皮功能失调与多种心血管疾病的发生和发展关系密切。研究表明，高血压、高血脂、高血糖、缺氧、衰老、吸烟等许多心血管疾病危险因素，都会使血管内皮细胞受损，引起内皮功能障碍。
1.1动脉粥样硬化氧化型的低密度脂蛋白是造成血管内皮细胞损伤的重要因素之一。血管内皮细胞受损后，分泌ET、AngII等促动脉粥样硬化物质增多以及促血栓形成有关。与血管内皮细胞之间的作用机制有，脂蛋白通过内皮屏障在内膜下沉积；巨噬细胞通过单核细胞的聚集和粘附在内膜沉积；内皮扩血管功能障碍时血管痉挛；内皮破损时血栓形成（1）。
1.2高血压内皮细胞功能失调或损伤时，会导致合成及分泌的调节血压的活性物质失调，缩血管物质分泌增多，而舒张血管物质分泌减少，外周血管阻力增加，血压随之升高。血压的升高进一步加重了内皮细胞的损伤，导致恶性循环。
1.3心力衰竭心力衰竭时内皮功能障碍的可能机制包括：血管紧张素转换酶活性增高加快缓激肽奖解；血流量减少使内皮NOS的表达减弱；内皮依赖性血管收缩物质如环氧合酶依赖因子的增多减弱了NO的扩血管作用；内皮受体信号传导途径受损（2）。
2药物对血管内皮细胞的保护的主要机制
功能减损的内皮细胞增加血管收缩因子的产生，增加血小板与内皮细胞的相互作用，增加白细胞粘附及平滑肌细胞的增生。因此，避免内皮损伤和保护已损伤的血管内皮，是防治心脑血管疾病的关键内容。现已证明有内皮保护功能的药物很多，如:ACEI类、钙拮抗剂、PGE1、肝素、维脑路通以及川芎嗪、天保宁等（5）。药物对血管内皮细胞保护作用途径主要有：
抗氧化剂作用实验证明目前临床使用的药物中如血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、沙坦类药物、胰岛素增敏剂以及雌激素都可以减轻由于氧化应激引起的内皮细胞功能异常，通过间接作用，影响内皮细胞功能来发挥保护作用。近年来天然产物中寻找抗氧化剂成为药物研究重要内容，如从中药丹参中发现的丹酚酸具有强抗氧化作用。
调节内皮细胞血管活性物质的分泌平衡，扩张血管，减轻血压过高对内皮细胞的损伤；调节脂代谢，改善血流动力学和凝血纤溶系统的功能（2）。劫抗细胞凋亡及细胞内钙离子超载。
3中药对血管内皮细胞保护作用研究及发展
现代医学研究表明，中药对保护血管内皮细胞、防止和减轻疾病发生发展过程中所存在的血管内皮功能失调有显著作用。
3.1活血化瘀药活血化瘀类中药在临床上很常用，对许多心血管疾病均有明显的防治效果。活血化瘀药的作用机制与其抗氧化、抗黏附附、调节血管内皮细胞功能，恢复纤溶，增强抗栓（4）等有密一切关系。如丹参清除氧自由基、抗黏附；川芎抑制脂质过氧化作用、抑制血管内纤溶酶原激活物抑制剂-1的表达来阻滞血栓的形成；水蛭稳定血管壁，保护内皮细胞；姜黄降低黏附分子的表达。
3.2补益药现代药理学研究表明，补益药对内皮功能也有多方面的作用。黄芪所含成分黄芪多糖可增强VEC与白细胞的黏附，促进淋巴细胞穿越内皮细胞进行细胞再循环。淫洋藿中的总黄酮对内皮素有强抑制作用，从而保护内皮细胞。女贞子、肉从蓉、何首乌等有显著的抗氧化作用，消除自由基及降血脂作用；党参、芍药、鹿茸、补骨脂、麦冬等能扩张冠状血管或外周血管，使血流量增加。
3.3复方药丽参注射液通过改善血管内皮细胞活性物质分泌发挥治疗血透相关性低血压；复方甘草合剂对高脂氧化损伤内皮细胞具有保护作用；栓释胶囊调节血管内皮倚赖性舒张、解毒化瘀汤抑制血栓调节蛋白，保护内皮细胞；六味地黄方缓解钙超载、抑制内皮细胞凋亡；麝香、冰片、黄连解毒汤抑制中性粒细胞黏附，聚集，保护血管内皮细胞（6）。
结束语：目前对中药对血管内皮细胞的损伤保护机制主要以单味药为主，研究药物作用对内皮细胞功能的保护及功能平衡的重建。此外也有不少学者研究中药在治疗心血管疾病中，血管内皮细胞分泌的相关血管活性物质及黏附分子的基因表达变化，试图从分子角度从内皮细胞的角度进行中药保护机制的研究以及进行心脑血管疾病药物的筛选。
参考文献
［1］血管内皮细胞与心血管疾病的关系及其研究进展刘群峰马虹心脏杂志2000，12（2）
［2］温绍君，刘洁琳，血管内皮细胞的功能研究概况生殖医学杂志，2005，14（5）
［3］赵建宏等，活学化瘀中药对血管内批细胞损伤大鼠凝血-纤溶功能的影响，中国中医药科技2001，8（5）
［4］施利兴，中药保护血管内皮细胞功能研究进展JournalofPharmaceuticalPractice，2005，23（6）
关键词：细胞生物学；教学改革；创新思维
中图分类号：G642.0文献标志码：A文章编号：1674-9324（2016）32-0210-02
细胞生物学是一门发展迅猛的生命科学基础学科，是现代生命科学的前沿分支学科之一，是高校生命科学学院本科生必修的专业基础课程。为了培养具有创新意识和创新思维的复合型生命科学及其应用领域的新型人才，必须深化细胞生物学教学改革，进行教育创新，其中包括教育理念、方法、手段、教材等的创新[1]。虽然目前的教学手段已从传统的手写口述改进到多媒体教学，具有图、文、声并茂的特点，大大提高了课题信息的传播速度和信息的容量，能够有效的激发学生的学习兴趣，但是，传统的以教师为主体的讲授模式依然存在。要实现培养创新型人才的教育目标，笔者结合自身的经验，提出以下几点建议。
一、精选教学内容，并结合学科的研究前沿
细胞生物学是一门发展迅猛的生命科学基础学科，每年有大量的新成果涌现，属于该学科的知识内容不断扩充和更新。我们以“细胞生物学”为主题，搜索数据库发现，每年有1～2万篇相关文章发表，而以“细胞”为主题的则每年有超过5万篇文章发表。因此，细胞生物学教学面临的新挑战就是知识的更新。除了要全面系统地掌握细胞生物学的教学内容，更要紧跟细胞生物学发展的最新动态，及时补充最新科研成果，力求授课内容新颖。由于教材编写的滞后性及当前科学研究进展的速度极快，即使最新的教材也不能及时吸取最新的研究成果。因此，要搜寻教材之外的相关资源，通过介绍最新的研究方向、技术和研究方法，着重培养学生的研究兴趣，将教材内容、科研进展、生活实例有机融合进课堂教学过程中，结合当前研究的最近进展，在有限的学时内，重点突出、条理分明的展现教学内容。编写教材时出于对知识结构的可控性及教学过程中的统一性，只将本领域内大家达成共识的确定性知识写进教材[2]，然而本着尊重科学的理念，教师可在课堂教学过程中选择性的将一些不曾出现在教材的知识介绍给学生，以拓宽学生的视野，活跃他们的思维，以期在他们的研究生涯中爆发出新的创意。
二、采用先进手段，进行立体化教学
细胞生物学是一门综合性强、内容繁多、较为抽象的学科，因此必须对教学方法进行创新，将传统的授课模式与多媒体技术相结合，利用多媒体技术全面、立体的展示教学内容，将教材上的静态描述变成动态图画展示出来，将平面的细胞图片由立体的模型展示出来，将微观的细胞以宏观的状态展现，使教学内容生动、形象、直观，既方便教师讲解又利于学生理解。但是，多媒体教学存在信息量过大、讲解速度过快的缺陷，因此课堂教学应重点突出。将传统课堂教学与新兴的“微课”[3]、“慕课”[4]结合起来，有深有浅、有繁有简，促进学生对教学内容的全面系统的理解。传统的“满堂灌”教学，常常由于忽视了学生的学习心理特点，变得沉闷、效率低，损伤了学生的学习积极性。课程组借鉴新的教学模式，使课堂教学效果得到显著提升。例如将“PBL”教学法和“BOPPPS”教学模式融入细胞生物学课堂教学中。PBL（Problembasedlearning，PBL）是基于问题的教学，源于杜威的问题教学法理论，1969年由美国的神经病学教授Barrowws在加拿大的麦克马斯特大学首创，目前已成为国际上较流行的一种教学方法，并已从当初的医学教育领域走向其他学科教育领域。PBL的实施包括这样几个基本步骤：根据学生需要掌握的基本概念和原理设计出要解决的实际问题，提供足够资料指导学生自学分组进行讨论、归纳和汇报，最后教师作总结、强化和矫正。在细胞生物学教学中，课程组精选出了一些重要科学研究案例，例如叶绿体、线粒体繁殖分裂机制、蛋白质分选信号学说、MPF发现及SRY性别决定调控机制等教学内容，通过引导学生进行问题设计、讨论与归纳、总结与矫正等环节开展学习。学生反馈说这种学习方式对于他们来说帮助非常大，将枯燥抽象的知识记忆转变为了理解学习的过程，对其科学思维训练非常有用。“BOPPPS”教学模式：根据心理学研究中发现的学生学习注意力规律特点，建立明确的教学目标、有效组织教学内容、吸引学生注意力的一种高效率教学模式。BOPPPS是导言（Bridge-in）、目标（Objective）、前测（Pre-assessment）、参与式学习（Participatorylearning）、后测（Post-assessment）和总结（Summary）六阶段课程设计的简称，是一种有效的教学结构，有效率、有效果的教学模式。
课程组教师吸收引进这种教学模式，运用在课堂教学，同时根据这种模式制作了《MPF发现》、《细胞衰老机制》等微课教学视频，获得了学生的广泛好评。另外，教师应结合自己的研究成果，让学生身临其境，直观的感受到所学领域的研究方式。
三、以学生为主体，激发其主动性和创新性
课堂教学过程中，教师主要讲解、学生被动灌输容易造成教师口干舌燥、学生昏昏欲睡的现象。而多媒体课件的信息量很大，有时候教师照着读，学生运笔如飞记笔记，也不利于学生及时理解教学内容，损伤了学生的积极性[5]。因此，教师课件应尽量多用图画来展示内容，一方面图画比较生动形象便于理解，另一方面图画也能引导教师以自己的理解来讲解，而不全照搬课件的文字内容。而要真正的实现以学生为中心，必须改变传统的课堂教学方式，采用比较新颖的“微课”、“慕课”等教学方式。针对细胞生物学课程中的重点内容和难懂内容，应让学生准备PPT，尽量用图画来展示自己的想法，从概念、原理、应用几个方面用5分钟的时间来解释清楚一个内容，鼓励学生发现问题、提出问题，大胆猜测、大胆提问。教师从学生对内容的理解和解释的准确性、表述的简明性、应用进展的新颖度几个方面予以评价。这方面的改进不但可以活跃课堂氛围，激活学生的创造性思维，还可以锻炼学生的自我表现能力和自信，对于培养新时代的创新型人才有很大的促进作用。长久以来，课堂教学都是以教师为中心、以课程为中心来进行的，学生接受的知识领域、容量、深度都受到教师对知识的理解深度和表达方式的限制[6]。在新形势下，以学生为主体的教学方式，在教师讲授课本知识的基础上，让学生对一个相关主题进行拓展，追踪研究前沿，尽量改善以前仅以课本为素材的教学对知识传授的有条件的限制。未知的事物对人的吸引力是无穷的，了解本学科的未知和不确定更能激发学生的好奇心和探索的热情。
四、改进传统的评价和模式，注重学生综合能力的培养
传统的课堂教学课后作业模式，所有人做同一个题目，难免会出现抄作业的现象，并且学生没有选择自己感兴趣的题目的机会。因此，课后作业应该和以上的学生课堂小讲座结合起来，让学生选择自己感兴趣的题目进行准备，并将科学研究的前沿与时下的热点问题联系起来，真正做到学有所用、学以致用[7]。细胞生物学有很多复杂、晦涩难懂的内容，细胞作为生命的最基本组成部分，非常重要却看不见摸不着，如何将细胞里面的微观世界跟我们的宏观世界联系起来，以及和日常生活的实例联系起来，就成了帮助和促进学生学好细胞生物学的重要工作。而学生根据自己的兴趣，自由选择题目，以简明扼要的语言、丰富多彩的图画在短短5分钟的时间内讲清楚一个问题、一个现象、一个原理，本身也是对学生的理解能力、归纳总结能力以及自我表现能力的大大提升。这不仅对本课程的学有帮助，更对我们培养创新型人才非常重要。在对学生的课程成绩进行评定时，设定课堂表现、创新精神、科学精神、表达能力等方面与课程卷面成绩并重，适当引入一些与当下研究热点、生活实际相关的能够考察学生综合能力的题目。
高校肩负着培养大批创新型人才的使命[8]，我们应该根据学科特点进行教学方法、教学内容、考核手段的创新，立足基础与能力培养并重，才能获得更好的教学效果。尽管目前细胞生物学教学存在一些问题，比如教学时数少、教师基础差别大等问题，但我们应一如既往的以培养学生创造性思维和探索精神为主导思想，在教学过程中不断探索、不断创新，为学生的培养和教育的创新做出更大的贡献。
参考文献：
[1]李绍军，高梅，陈坤明，胡景江.农林综合性院校细胞生物学教学改革及课程体系优化[J].高等农业教育，2014，（7）：54-57.
[2]周守军，郑忠梅.现代大学教学改革：面向不确定性知识[J].中国高教研究，2010，（1）：81-83.
[3]余胜泉，陈敏.基于学习元平台的微课设计[J].开放教育研究，2014，（1）：100-110.
[4]刘继斌，赵晓宇，黄纪军，刘培国.Mooc对我国大学课程教学改革的启示[J].高等教育研究学报，2013，36（4）：7-9.
[5]赵伟，马德俊.高校传统教学模式的分析与思考[J].中国科教创新导刊，2009，（31）：120.
[6]卢晓东.如何破解“钱学森之问”？――兼论创新人才培养与大学教学改革[J].中国高校科技，2011，（7）：9-12.