关键词：聚氨酯泡沫；生物降解；填充；土壤掩埋；微晶纤维素
中图分类号：TQ328.3文献标识码:A
硬质聚氨酯泡沫塑料（RPUF）绝热效果好，比强度大，电学性能及隔音效果优越，而且通过调整配方，可以制成不同规格的制品以满足不同要求，作为一种绝热保温与结构材料，已经广泛地应用于建筑、冷藏、航空航天等领域[1]。然而其使用后的废弃物因在自然条件下难以降解，给人类赖以生存的环境造成了不可忽视的负面影响。因此研究和开发可生物降解型聚氨酯材料迫在眉睫。将一些易于生物降解材料填充到聚氨酯中，是研发生物降解型聚氨酯材料的一个重要方向[2-6]。
纤维素是地球上储藏量最大的天然高分子，作为可再生的天然材料是生物降解材料的良好原料[7-9]。本文采用聚醚多元醇和多异氰酸酯为主要原料，在聚氨酯发泡过程中加入微晶纤维素，制备了填充型可生物降解硬质聚氨酯泡沫塑料（RPUF）并研究了其力学和降解性能。
1实验部分
1.1原材料
聚醚N303，天津石化三厂；[0]多苯基多亚甲基多异氰酸酯（PAPI），烟台万华聚氨酯股份有限公司；硅油AK8807、三乙醇胺，分析纯，成都化学试剂厂；微晶纤维素（MCC），西安北方惠安精细化工有限公司公司生产；微晶纤维素使用前经真空烘箱干燥至恒重，存储于干燥器中备用；水为蒸馏水。
1.2仪器与设备
电热鼓风恒温干燥箱，DB210SC型，成都天字试验设备有限责任公司；增力电动搅拌器，JJ-1型，江苏金坛市医疗仪器厂；模塑成型模具，自制；扫描电子显微镜，S440型，LeicaCambridge公司；红外光谱仪，?Nicolet-5700型，美国尼高力仪器公司；热重分析仪，TGA-SDTA851型，德国耐驰公司；电子万能材料试验机，AG-1OTA型，日本岛津公司；简支梁冲击实验机，XJJ-5型，承德材料实验机厂。
1.3微晶纤维素填充可生物降解RPUF的制备
首先将一定比例的聚醚多元醇N303、三乙醇胺、硅油AK8807、水和微晶纤维素配制成一组分，并搅拌均匀记作A组分；多苯基多亚甲基多异氰酸酯（PAPI）作为B组分。上述两组分的温度调节到22℃左右，然后将B组分倒入A组分中经高速搅拌均匀后浇注入预热到45℃左右的模具内发泡成型。经熟化处理脱模后得到材料样品，然后按要求加工成所需试件，进行相关的性能测试。
1.4力学性能测试
压缩性能：参照GB/T8813-88进行,试件尺寸为Φ50mm×50mm,测试时的横梁速度为5.00mm/min，温度25℃，湿度65%RH；
冲击性能：参照GB/T11548-89塑料冲击实验方法进行,试件尺寸为10mm×15mm×120mm，摆锤能量1J，温度25℃，湿度65%RH。
1.5降解性能测试
所制备样品的降解性能表征采用户外土埋法降解实验法进行：将样品按一定间隔埋入普通园艺土壤下约10cm处，让其在自然条件下降解。每隔一段时间，从土壤中取出一些硬质聚氨酯泡沫样品，用去离子水小心清洗，然后在50℃电热鼓风干燥箱中放置24h，进行干燥。最后再在常温常湿的条件下至少平衡24h，做如下表征：
(1)失重率：失重(%)=[(W0-WS)/W0]×100计算，式中：W0-泡沫体原始质量；WS-降解后泡沫体质量。
(2)红外分析：降解产物的红外光谱用KBr压片法测试。
(3)热重分析：降解产物的热重分析在氮气氛下测试，升温速度10℃/min，温度范围：常温-700℃。
(4)扫描电子显微镜：取降解产物试样脆断，对断面进行喷金处理后用扫描电子显微镜测断面形态，加速电压为20KV。
2结果与讨论
2.1填料在RPUF中的最大填充量
制备出的硬质聚氨酯泡沫塑料的密度为0.1g/cm3左右，当微晶纤维素的添加量在80份(23.3wt%)以下时，发泡充分，样品表面平整，未出现收缩现象。进一步提高填充量，由于表面填料较多,使泡沫无法支持,出现塌泡现象，样品出现明显的收缩，因此最大填充量约为23.3wt%。
2.2微晶纤维素填充可生物降解RPUF的力学性能
微晶纤维素填充可生物降解RPUF的压缩强度与冲击强度与填料用料的关系如图1所示。当少量微晶纤维素加入RPUF基体后，其压缩性能和冲击性能均有大幅度的下降，此时聚氨酯分子间的相互作用以及交联结构已在一定程度受到影响，而填料与聚氨酯之间的相互作用也较弱，因此导致其力学性能下降。随着填料用量的增大，填料分子与聚氨酯分子键的相互作用增强，使其压缩强度有所改善；进一步增加填料用量时，试样的压缩强度开始减小，这可能由于RPUF在受压时主要由聚氨酯基体构成的泡孔壁和支柱来承受外力，而过高含量的填料降低了基体树脂含量，故压缩性能下降。而冲击性能随着填料用量的增加却未得到改善，这可能因为微晶纤维素填料本身性脆，与聚氨酯基体相容性差，使得填料和基体界面间相互作用较弱，当样品受冲击断裂时，裂纹扩展在填料和基体界面间进行，填料含量越多裂纹扩展越严重，试样的冲击性能就越差。
2.3微晶纤维素填充可生物降解RPUF的降解性能
2.3.1土壤微生物处理下微晶纤维素填充RPUF失重和FTIR分析
经过不同的时间间隔后，样品的失重情况如图2所示。图2(a)中可以看出，样品降解120天后的失重率随微晶纤维素用量的增大而增大；
(b)填料用量80份时，失重率―时间关系
图2微晶纤维素填充可生物降解RPUF
土壤掩埋试验后的失重率
图2(b)中当填料用量均为80份时，失重率随降解时间的延长而增大，120天后失重率可达10.8wt%。
图3为微晶纤维素填充硬质聚氨酯泡沫塑料降解产物的红外光谱图。图3(a)中当微晶纤维素填充量为80份时，样品在1730cm-1处的氨酯键中羰基吸收峰随着降解时间延长逐渐变弱，说明样品中的氨酯键在土壤微生物的作用下发生断裂，时间越长降解效果越好。图3(b)为不同微晶纤维素填充量的RPUF降解120天后的红外谱图，从图中可以看出样品氨酯键中羰基吸收峰随着填料用量增大逐渐变弱，说明微晶纤维素含量越高，样品越易于生物降解。
2.3.2土壤微生物处理下微晶纤维素填充RPUF热重分析
分别对不同降解时间以及不同填充量的降解样品进行TG分析，结果列于表1、表2中。从表1可以看出，随着土壤掩埋时间的延长，样品的最大热分解速率温度逐渐降低说明了泡沫体的立体网状结构受到损坏，发生了降解，并且时间越长，降解效果越明显。而表2中样品的最大热分解速率温度随着微晶纤维素用量的增加逐渐降低表明填料越多，样品越易于生物降解。
2.3.3土壤微生物降解处理后微晶纤维素填充RPUF的表面形貌变化
用扫描电子显微镜观察了微晶纤维素填充RPUF在土壤微生物的作用下表面形貌的变化。在土壤微生物降解前微晶纤维素填充量为80份的RPUF表面平整,微孔致密均匀(图4A)，随着土壤微生物降解时间的延长，孔洞变大，松散，不均匀(图4B)，孔洞破损逐渐变大(图4C)。在放大2000倍的SEM照片中可以看见样品表面被微生物侵蚀后的碎片（图4D）。这进一步说明微生物对聚氨酯的结构有所破坏。同样在图5中可以看出在降解周期相同的条件(均为120天)下，微晶纤维素含量越高的样品受微生物侵蚀破坏的越严重。这与以上红外以及热重分析得到的结果一致。
3结论
本文在普通聚氨酯泡沫中加入易于生物降解的微晶纤维素制得了密度为0.1g/cm3左右，外观和力学性能良好的填充型可生物降解聚氨酯泡沫塑料，最大填充量达23.3wt%，土壤掩埋实验证明样品具有一定的生物降解性，最大填充量的样品经过120天土壤微生物降解后失重率可达10.8wt%。
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作者简介：
【关键词】DGGE；微生态；纯培养
1.DGGE技术的原理
变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据小片段DNA分子（1kb以下）的熔解温度不同来分析DNA分子的多样性，理论上可以检测到单个碱基替换的DNA分子。DN段在丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于自身的物理性状，熔解状态的DNA分子片段在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度比双链DNA分子慢[4]。当DN段处在变性剂浓度不断增加的凝胶系统中，随着电泳的迁移就会部分融化，达到一定变性剂浓度时DNA就会熔解为单链的分子，这些离散的碎片集中在一个比较狭窄的变形梯度范围内，这样不同的DNA分子在不同变性剂浓度下熔解，在整个电泳图谱中成楼梯式排列。通过对比熔解状态下DN段的多态性，就可以推测有碱基突变或序列差异的DNA分子片段。
为了提高检出率可在DNA一端加入一个高熔点区―GC夹（GCclamp）；GC夹就是在一侧引物的5′端加上一个30～40bp的连续GC碱基，这样在PCR产物的一侧可产生一个GC夹的高熔点区，从而使相应的部分序列处于低熔点区而便于检测分析；这样，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%[4]。
2.DGGE技术在微生物生态学中的应用
自然界中85%～99.9%的微生物是不可纯培养的[5]，并且微生物的形态具有难观测性和可变性，在传统的实验方法下不能提供足够的微生物学信息，这严重阻碍了对自然环境中微生物构成及特征的客观认识。PCR-DGGE技术在微生物生态学中的一个最主要的应用就是分析微生物群落构成，Muyzer等人于1993年首次将DGGE技术应用于微生物膜系统和生物菌苔的群落多样性分析。此后，该技术被广泛应用于各种微生物生态系统的检测，绝大部分研究都是通过扩增原核生物16SrDNA基因来研究各生态系统中的古细菌或细菌的群落多样性[6]，或者用真菌的通用引物扩增18SrDNA基因，从而研究真菌的群落多样性，另外除了通过rDNA基因来分析微生物群落结构组成外，还可以通过扩增功能性基因来研究功能基因及功能菌群的差异。
Lam等利用DGGE技术对真菌18SrDNA的序列进行分析，研究Magnolialiliifera叶片中真菌的多样性，结果在叶片的不同部位得到通过培养和形态学研究未能得到的14株不同菌株[7]。Eeva等对挪威红杉残枝样本直接进行DNA提取，利用DGGE分析通过FR1和NS1引物对扩增的1650bprDN段，结果得到了46株木材腐烂真菌，为真菌群体中难培养的菌株的检测提供了新的方法[8]。Zhou等对藏灵菇发酵液里的真菌和细菌的DNA进行提取后，扩增细菌16SrRNA和真菌28SrRNA上的相应片段，之后用DGGE进行分析得到11株优势菌株，并且在不同样本之间细菌存在78～84%的相似度，酵母存在80-92%的相似度[9]。
PCR-DGGE技术在微生物生态学中的另一个重要应用是检测微生物的动态变化。宋亚娜等运用16SrDNA和18SrDNA特异性引物对，将土壤中提取的总DNA进行PCR扩增后，通过DGGE技术对PCR产物进行分析，研究不同间作和轮作种植体系对作物根际真菌和细菌菌落结构的影响，结果表明，间作明显改变玉米的根际细菌、真菌的菌落结构[10]。Takada利用PCR-DGGE研究化学熏蒸后对散土和菠菜根部土壤中真菌群落的变化，结果表明，三氯硝基甲熏蒸两个月后，在散土和菠菜根部土壤中真菌的多样性都减少，并且一年后真菌的多样性并没有完全恢复到原来的水平，但是菠菜根部土壤中真菌减少量比散土中要少，1，3-二氯丙烯处理两个月后，真菌的多样性只发生微小的改变，并且六个月后就与对照组没有显著差异了[11]。
PCR-DGGE技术还可用于发现新的微生物菌株。Santegoeds等通过DGGE分析细菌16SrRNA上的基因片段来检测多次富集培养的菌藻系，得到了14条独特的16SrRNA基因序列，其中有10个细菌株的基因是以前利用纯培养手段及单纯的分子技术方法均没有发现的[12]。
3.DGGE技术的局限性及改进方法
DGGE技术作为一种分子生物学手段在研究微生物群落的动态行为和复杂性方面发挥着重要的作用，是目前被普遍接受的的分子生物学工具，但是作为一种分子水平上的技术，除了具有多数分子技术所固有的缺点之外（如PCR产物偏差等），本身也有一定的应用局限性。
首先，利用DGGE分离的PCR产物一般要求DNA长度在200～700bp范围内[1]，超出该范围DGGE的分辨率会下降，然而这些序列只能提供有限的系统发育信息，不利于判断微生物所属的系统类群。其次，DGGE通常显示的是微生物群落中的优势种群，Muyzer研究发现该技术只能对菌体数量大于总菌量1%的菌群进行分析[1]。再次，每种菌可能含有数目不等的rRNA基因[13]，则可能会导致群落中菌株数量被过多的估计从而夸大群落差异性和多态性。另外，如果选用的条件不是特别适宜就不能保证将每类DN段完全分开，这样序列不同的DN段迁移到凝胶的同一位置，导致同一条带中含有不同种类的细菌[14]。
对于DGGE存在的这些缺限我们可以通过各种手段加以改善，例如可以优化电泳及PCR的条件从而减少误差，并且在进行DGGE之前通过软件来分析检测PCR过程中形成的嵌合体，另外，可以与其他技术方法相结合，如纯培养、直接形态观察、原位杂交、核酸探针检测技术等，这样不仅更客观的从多方面反映环境中微生物的多样性信息，还可以与其他方法相互补充，从而不断提高分子微生物生态学的研究水平。DGGE技术与传统方法或其它分子生物技术的结合进一步促进了人们对微生物生态的认识；随着分子生物学技术的快速发展，DGGE技术将会得到不断的补充和完善，必将在微生物生态研究中发挥更大的作用。
【参考文献】
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关键词：微课；设计；反思；教学方式
微课是一种微型的课程，主要是通过微型的教学视频对学科知识点进行在线视频教学。它的优势主要体现在主体明确，资源多样化以及结构独立。而对初中科学进行微课的设计与反思，能够有效地激发学生的兴趣，有效强化教学效果，提高学生的科学水平，为学生今后其他学科的学习奠定基础。
一、科学的微课设计
1.微课选题
要设计科学微课，最先要做的就是进行微课选题。而微课选题要确定范围以及突出重点，且要有针对性。例如，在华师大版初中科学七年级上册第七章生物的多样性第一节《生物物种的多样性》的教学中，教师就可以针对这节知识来进行微课选题，让学生通过微课课题了解所要学习的知识点以及重要知识等，以此强化教学效率。
2.微课问题设计
通过问题，能够激发学生的求知欲，让学生能够通过对问题进行探究提供对学科知识的认识。由此，教师在进行科学这门学科的微课设计中，应注重进行微课问题设计，让学生通过解决问题来了解与学科相关的知识，提高对科学的认知。例如，在《生物物种的多样性》的微课问题设计中，教师就可以根据这一节的内容，来设计问题，譬如这一节的重点是物种的多样性，难点是理解生物多样性的三种含义以及确定生物物种的三个条件，教师就可以以此来设计像“请同学们通过视频以及课本上的内容来探讨物种的多样性”等与知识点相关的问题，让学生能够在解答问题的过程中学习知识，深化知识。
3.微课学习环境设计
微课的学习是需要一定的平台才能实现的，由此教师在进行科学的微课设计时，必须重视微课学习环境的设计。微课学习环节的设计必须要视具体情况而定，也就是要针对不同的学习内容与学习目标来制订。例如，在《生物物种的多样性》的微课设计中，教师就可以针对章节内容对微课学习环境进行设计。本节的重点是让学生能够理解物种的多样性，教师就可以借助多媒体资源以及一些毛色不同的猫狗等观察图向学生展示，为学生创设微课的学习环境。
4.微课教学活动过程设计
微课设计是一种结构的构建，是将教学活动的思路、重点与难点、教学过程、教学组织等进行整合的一个过程，而这个过程中，教学活动设计尤为重要。故而，教师必须认识到微课教学活动过程设计在科学微课设计中是重要的一个部分。而进行微课教学活动过程设计，就需要教师具有构建主义的能力与剖析教材内容的能力，如此才能进行有效的微课教学活动过程设计，从而提高学生的学习效率。当然，教师还必须注重对教材的分析与理解，在科学微课设计活动过程中注重渗透教材与教学内容。例如，在《生物物种的多样性》的微课教学活动设计中，教师首先需要将《生物物种的多样性》这一节的教学内容进行分析。其次就是通过教材确定《生物物种的多样性》的教学目标：帮助学生了解生物物种的多样性含义，生物物种多样性对人类生存环境的影响。教学重难点：物种的多样性以及物种多样性的三种含义和确定生物物种的三个条件；教学过程围绕什么是物种，如何确定生物物种展开。就这三个方面进行有效整合与构建，以此为主要内容进行科学微课教学活动过程设计，从而让学生能够更有效率地进行学习。
二、科学微课的设计反思
科学微课的设计是一种以教学资源为承载的教学方式，故而并没有强而有力的理论依据。由此，教师要设计行之有效的科学微课，要想通过微课教学提高学生的科学水平，教师就需要建立设计理论的相关原型，也就是具体的实践。因此，在微课教学过程中，教师需要将学生的表现与教师的教学情况进行统计与总结，并进行反馈，并不断进行完善，再将这些结果运用于具体的教学过程中，以此来检验科学微课的设计是否合理。如此才能实现不断修正科学微课教学中所存在的问题，提高科学微课教学的质量与水平。
科学微课是一种较为有效的教学方式，对微课教学进行研究，是不断提高教学过程的过程。在科学微课的设计与反思的过程中，为科学教育教学提供了强有力的理论与实践的基础，有效地提高了科学课程的教学效果。当然，在科学微课的教学中，还是存在着亟待解决的问题，这就需要更多教师在实际的教学中进行实践与探索，从而更好地进行科学微课的设计与反思。
参考文献：
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关键词：微量物证；概念；侦查；作用
随着人们文化素质的提高和物证科学技术常识的普及，在造福社会的同时，也促进了犯罪技术水平和反侦查手段的提高，作案手段和方法不断更新，事前精心策划、事中处处伪造、事后极力破坏，如戴手套作案，擦洗凶器，销毁笔记本、账簿、衣物、鞋子，伪装笔记等。侦查人员在现场勘查中很难采集到有价值的手印、鞋印等人身证据，传统物证技术受到挑战，必须开发新的物证项目。
微量物证检验科学技术应运而生，这是由于引入物证技术领域的高科技装备越来越先进，是检验人能借助于现代显微放大仪器寻找肉眼看不到的微量物证客体，利用高精密度仪器分析微量物质，逐步实现了仪器取代人眼的革命。在重特大的疑难案件的侦破中，微量物证的分析起到了决定性的作用，进而为科学、准确、快捷的办案提供了便利条件，维护了法律的尊严。
一、微量物证的概念及其特征
1.微量物证的概念
20世纪70年代末期，日本、美国等发达国家司法鉴定机关率先普及使用扫描电镜、射线显微分析仪、质谱仪、气象色谱仪、液相色谱仪等高精密度理化分析仪器，只需采集和检验极少量物证样品量，即可分析出物证样品的种属特性①。因此，警务人员在现场勘查中注重搜查那些不被犯罪分子所注意和破坏的金属残渣、灰土、纤维等微量残留物，由此而诞生了“微量物证”（Traceevidence）这一新概念。
对于“微量物证”这一新名词，目前尚无统一认识，争议颇多，较为流行的说法是将“微量”解释为“微小”，将“微量物证”简称为“微物”②。实际上，“微量”的含义不仅仅指的是物质体积小，而且还具有数量少的意思，不能一味地以表示体积“微小”加以代替，更不能将“微量物证”简称为“微物”。
根据洛卡德的物质交换原理，凡物体与物体之间发生接触后会存在物质的转移，目标物体会从源物体上带走一些物质，同时也会将自身的一些物质遗留在源物体上。通过对转移物质的检验，能够反映其源物体与目标物体的某些特征，也可以证明发生接触的物体的相互关系。在犯罪现场，犯罪嫌疑人在实施犯罪的整个过程中，由于行为与犯罪现场的接触，必然会遗留或带走某些物质，其中那些可以用以揭示和证实犯罪事实的物质，统称为“物证”。而那些与犯罪活动有关，能用以认定犯罪事实真相，但需要借助专门检测仪器进行检验、鉴定的量小体微、易被污染和丢失的物证，即是微量物证，其形成通常是由于外界的交互作用而产生的物体间的微量物质转移。在某些情况下，某种物理化学作用也会引起程度不一的微量物质的转移，结果使物体上增加了某种微量物质或导致某种微量物质的物理化学性质有所改变。这些微量物质的存在和变化也可能成为证明该待查犯罪事实的证据。综上，可以将微量物证定义为：附着在与犯罪有关客体上的能够揭露和证实犯罪事实的量少体微物质。“附着”一词揭露的是微量物证的本质即“脱离母体的分离体”。分离体由于“擦刮”“擦蹭”“分泌”“脱落”等作用而脱离于母体（源物体），依附在其他目标客体之上。溯其本源，通过研究分离体及其运动的轨迹可以分析出母体的种属特性、分离因素等。该定义中的“与犯罪有关的客体”在通常情况下包括当事人的身体、鞋帽、衣物，作案时所使用的工具，现场上所破坏或遗留的有关物品，现场建筑物墙面、地面，文件以及其他物品。
2.微量物证的特点
微量物证除了具有一般物证如传统上所指的手印、鞋印、工具痕迹、笔迹等物证的特点，有着其自身的特性：
⑴广泛多样性。微量物证范围广泛，种类多样，犯罪现场的任何物质均可能成为物证。微量物证可以使化合物，也可以是单体，可以是有机物，也可以是无机物或合成材料。随着新材料的不断涌现，物证的范围不断扩大。
⑵依附性。微量物证常发现于犯罪现场周围或附着在与犯罪有关的客体上，如犯罪嫌疑人、被害人人身以及作案工具等。微量物证的这一特性表明，应尽可能在犯罪嫌疑人、被害人、作案工具上提取微量物证，以便相互印证。
⑶不完整性。犯罪现场提取的微量物证通常是从其整体物分离而成，并不是造痕体在运动中产生的痕迹，它以破碎、分离的形式出现，缺乏反映完整物的形象。因此，对微量物证检测结果，应结合犯罪现场勘查、案情调查及相关证据进行综合分析，才能做出正确的判断。
⑷隐秘性。微量物证由于其量小体微，使其具有强烈的隐秘性。这一特点使它不容易被犯罪嫌疑人注意而销毁，但同时容易被现场勘查人员忽略而难以发现和收集，或提取的时候也容易发生污染或丢失。正因如此，微量物证的鉴定通常也需要借助化学分析手段或高精密度仪器才能检验。
⑸易污染，易丢失。由于微量物证的附着性，又因其体积小，很容易与周围环境或其他物质发生交叉污染。同时，在提取、包装和鉴定过程中如有不慎操作就会造成污染或丢失从而丧失证据价值。
⑹出现的几率高。微量物证由于其量小体微，很容易遗留在犯罪现场或从犯罪现场被带走，且难以全部销毁，在犯罪现场及其周围和犯罪嫌疑人身上出现的几率非常高③。
二、微量物证分析在侦查破案中的作用
犯罪嫌疑人实施犯罪活动总要采取某种手段，使用某种物质材料，不可避免地会将其带至犯罪现场，并遗留微小的物质在犯罪现场，因此，在案发现场或被害人身上或犯罪嫌疑人身上及作案工具等其他客体上必然会黏附这些物质。事实上，我国是使用微量物证最早的国家，如足迹专家马玉林的步法追踪，就是成功运用微量物证的典型，通过作案人足迹运动产生的微量泥沙、擦蹭痕迹来研究分析作案人在现场的运动轨迹④。随着鉴定技术的进一步发展，利用微量物证侦破案件逐渐受到公安部门的重视。因此，在侦查实践当中，掌握发现、提取和利用微量物证分析方法，对于侦查破案具有重要的意义。
1.有助于查明作案手段
通过现场勘查和物证分析，可以查明作案手段。如爆炸案中，可以确定爆炸原因、爆炸物的种类以及爆炸量，同时可以确定纵火案的起火原因、起火点和纵火物的种类。再如通过至伤工具残留物的检查分析和对比，可以判断致伤物的物质和工具。通过确定制作或伪造文件所使用的工具材料等，可以澄清某些案件事实，并可甄别被害人的陈述或犯罪嫌疑人的口供。
2.有助于确定侦查方向
通过物证分析，确定物证的物质种类或品牌，或分析确定该物质属于哪个批次的产品，在调查该种物质的分析情况和销售范围基础上，确定该物质的来源。以便按照“以物定向”的原则确定侦查工作的方向和范围。如扼颈他杀现场发现缠绕在死者颈部的绳索是一种特殊的尼龙绳，经调查取样分析后，是现场附近某工厂生产的产品，这种产品作为农业生产资料在当地销售，那么该地就是重点侦查范围。
3.有助于确定犯罪嫌疑人
认定谁是犯罪嫌疑人，需要有足够的证据，从微量物证分析的角度提供证据，就要求从两个方面去证实犯罪事实：犯罪现场或被害人身上遗留有犯罪嫌疑人身上的或其他作案使用的工具、材料上的物证。如犯罪嫌疑人作案后越窗逃跑时，在窗框上留下的几根衣服纤维，用刺器刺伤被害人时，在被害人衣服破口处留下的少量污垢，经过对留在窗框的纤维、衣服破口的污垢进行分析，确定纤维和污垢的种类、质地、组分，再与犯罪嫌疑人身穿毛衣的纤维及疑是凶器上的附着物进行比对，如果其种类、组分相同，则这些物证可以作为确认犯罪嫌疑人的证据之一。如果在犯罪嫌疑人身上或疑是凶器、交通工具上留有案发现场或被害人身上的某种特殊物质，也能证明犯罪嫌疑人曾到过案发现场，或接触过被害人。
4.有助于证明遗书等文件的真伪
文件的真伪可以通过文件鉴定来解决。但应用微量物证分析法比较鉴别遗书上的墨水、油墨等物质材料的异同，也可以证明遗书等文件的添改事实。如死者亲属对死者“自杀”一事提出异议，经检验“遗书”发现，遗书上标明死者厌世的关键词和改写的落款日期，都是用另一种相似油墨的圆珠笔添改的，表明遗书是伪造的。案件侦破后证实死者生前在病中给其亲属写了一封信，让其丈夫寄出，其夫模仿其笔记对原信作了添改并扼死死者，伪装自缢身亡。
三、微量物证分析的程序和结论
微量物证分析在案件侦破工作中具有非常重要的意义。实践工作中应把握以下重要环节，才能发挥其应有的作用：
1.认真区分物证和无关物质
物质无处不在，特别是作为散在物、残留物或某种痕迹的媒质的微量物质。在犯罪现场勘查或对犯罪嫌疑人的搜查中，要善于发现和提取到能证明有关案件事实的微量物证，就必须结合案件的具体情况，在对案件性质、侵害对象、作案手段和作案过程的基本认识的基础上，弄清物质与作案活动的必然联系，才能在正确区分哪些是作案活动遗留的或产生的，哪些是现场固有的；哪些是从犯罪现场带来的或作案过程剩余的，哪些是与该案件无关的。否则，把无关物质误做物证，花费精力和财力是毫无意义的，而且可能造成错案。为此，物证分析人员应亲自参加犯罪现场勘查，协助侦查人员勘查、提取可疑微量物证。受理和送检的微量物证，应详细了解案情，认清提取物证的部位、方法和原始状况，以及该物证对查明案件事实的作用。
2.制定科学、高效的检验方案
要确定一种未知的物质是何物，以及它与某个样品是否相同，需要一个实验、探索的过程。但作为微量物证，它不仅量微，而且对于某特定案件是不可替代的。为了防止无谓的消耗物证，给案件侦破造成无可挽回的损失，必须结合案情，对物证进行外观观察与无损检验，在排除某些种类物质后，判定它可能是某种什么物质，在明确检验范围的基础上，拟定进一步实施检验的步骤和要采取的分析方法。要力争做到消耗每一部分样品，都能获取最大限度的进展。务必防止盲目的试探和无序的无准备、无计划的检验。
3.坚持系统、综合的检验
坚持系统、综合的检验，包含以下要求：首先，要把物证作为特定案件系统中的一个组成部分，看成是案件系统中一个有多组分、以一定形式和次序构成的子系统。也就是说，物证不是孤立的，它与案件有着千丝万缕的内在联系，才能更有效地证明案件事实。其次，要从宏观到微观，从整体到局部，从一种组分到其他组分，全面实施分析检测，以到达充分提取物证的全部信息。这样才能利用有限的微量物证，最大限度地鉴别物质的种类，以至获取具有特定意义的结论依据。最后，要综合分析检测结果，从案件的实际出发，做出微量物证的鉴定结论。微量物证鉴定要尊重分析结果，同时也应注重对分析结果的综合。因为只有综合才能更准确地认识物质种类的异同，才能把握物证案件事实的联系。
4.严格区分相同与同一
微量物证分析的结论：物证与某样品相同⑤。意思是说待见物证与相比较的样品彼此一样，没有区别。它在不同情况下具有不同的含义：如果判定其相同的根据是该种物质的种属特征，是构成该种物质的必然部分及其含量，这种相同是指相比较的是同种物质，或者说是物质种类相同。由于具有同种物质的人或地点绝非一人或一处，这种结论只能证明微量物证有可能来自该人或该处，而不是一种肯定的、排他性的证明。如果说“相同”，除根据物证中某种物质的必反组分，有根据其中偶然混杂的其他物质的组分，而且这种混杂的组分愈是偶然，这种相同就愈具有特定意义。例如，从一具被撞击致死的尸体衣服上提取的擦蹭附着物经分析为蓝色油漆，玉米叶残渣，生石灰渣和尘土的混合物。经侦查发现的可疑车辆车厢下方的金属防护网有擦蹭痕迹，刮取其前角附着的白色粉末、油漆及其表面附着物进行分析，其总和与被害人衣服上的擦蹭附着物提取的微量物证组分完全相同。由于这几种物质难以在其他车辆的同一部分出现，该结论就证明了死者衣服上的附着物只能来自于这辆可疑肇事汽车。因此，所谓严格区分相同与同一，就是要科学、客观地评估微量物证鉴定结论的证据意义⑥。
微量物证的提出，使我们对现场物证的认识更深一步，扩大了视野，标志着物证的发现、提取与鉴定由宏观深入到围观，由平面深入到立体，是现代高科技成果在物证技术领域内运用的具体表现，也是物证技术鉴定水平的重大进步。微量物证概念拓宽了在物证技术中提取与检验对象的范围，特别是对那些监守自盗、预谋、纵火、枪击、反侦查等难以侦破的案件具有重要意义，从现场这一“物证宝库”的多个方面，层次揭露犯罪事实，为稳、准、狠地打击狡猾的犯罪分子提供了锐利武器。
引文注释
①李文.物证技术学导论[M].北京：中国人民公安大学出版社，2009.
②周学之.微量物证学论文集[M].上海市新闻出版局，1998.
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④杨瑞琴.微量物证在司法实践中的作用[J].公安大学学报，2002（2）.
⑤张绍雨.关于微量物证若干问题的探讨[J].福建公安高等专科学校学报，2001（1）.
一、样品处理方法
实验室结果表明酸提取法适用于水果、蔬菜，而不太适用于肉制品的消化；HNO3-HCI则适用于几乎所有的样品消化，获得的结果与干法灰化的测定值相符。这两种方法具有简便、快速和准确的优点。我们认为酸提取法和HNO3-HCI顺序消化法均适宜作食品中铜、锌、铅测定的例行方法。下面介绍日前常见的干法和湿法，应用于食品样品处理。
(一)干法灰化处理
干法灰化处理是先去除样品中杂物，称取定克数样品置于瓷增锅中，先在微火上干燥，目的是除去其中的水分和易挥发性组分。然后移入高温炉中灰化成白色灰烬，灼烧后所得的灰分加入盐酸溶液加热煮沸，经冷却移入容量瓶中混匀备用。该法的优点是能分解大量样品，方法简单，无试剂污染，空白低；缺点是对于低沸点的元素常有损失，损失程度取决于灰化温度和灰化时问，以及元素在样品中的存在状态。
(二)湿法消化处理
湿法消化处理又称氧化分解法。用液体或液体和固体的混合物作为氧化剂，在一定温度下分解样品中的有机物，此过程称为湿法灰化。此法与干法灰化的不同在于它不是依靠温度的提高，而主要依靠氧化剂的氧化能力分解有机物。常用的氧化剂有HN03、H2SO4、H2O2、KMNO4等。二、微量元素的分析方法(一)原子吸收分光光度法(AAS)原子吸收分光光度法的测量对象是呈原子状态的金属元素和部分非金属元素。利用待测元素所产生的基态原子对其特征谱线的吸收程度来进行定量分析的方法。具有灵敏度高、选择性强、分析范围广、精密度高、准确性好等优点。所用的仪器为原子吸收分光光度计(日本日立仪器公司)，其中原子化系统是关键组成部件，其作用是将样品中的待测元素转化为自由态原子蒸气。原子化装置般包括火焰原子化系统、石墨炉(无火焰)原子化系统和氢化物发生器2种类型。
氢化物发生进样的原理是某些元素如砷、锑、铭、锡、锗等与合适的还原剂(如硼氢化钠)发生反应，可形成气态氢化物，汞可生成气态原子态汞，福、锌可生成气态组分。生成的氢化物被引入到特殊设计的石英炉中进行原子化。氢化物发生进样的优点是消除干扰、进样效率高、易实现自动化和可进行价态分析等。氢化物原子吸收光谱法(HG―AAS)也广泛地在原子吸收光谱法中使用。
对于酒和饮料等食品多采用石墨炉原子吸收光谱法对其中锰、锡等微量元素进行测定，日前较多的使用方法是谱法(HPLC―HG-ASS)对固态样品和复杂样品中的微量元素进行测定。
(二)电感藕合等离子体原子发射光谱
此法工作原理是将分析样品(溶液)由喷雾器雾化，然后再引导至高频等离子体火馅中去，于此激发后发光。由样品发出的光进入分光器，分光成光谱，从中得到所分析元素的光谱线，此光变换成电流后被输入到测光装置，根据电流强度显示值，即可知道样品中各种成分的含量。
该方法主要优点是：具有检出限低、精密度高、曝光时间短、基体效应小、测量的动态范围宽和多元素同时测定等。已在食品微量元素分析中得到广泛应用。对于食醋等液态样品可以经稀释后直接应用ICP-AES进行测定。流动注身个氢化物发生进样同样适用于电感藕合等离子体原子发射光谱法，将流动注射氢化物发生进样与多道等离子体光谱仪联用，测定了高盐食品试样中痕量铅的含量。用氢化物发生一电感藕合等离子体原子发射光谱(HG―ICP-AES)测定生物样品中的痕量铅，结果令人满意。建立了悬浮体制样电热蒸发一电感藕合等离子体原子发射光谱(ETV-ICP-AES)法直接同时测定食品中微量元素的方法，并对玉米粉中的钙、铁、锰、铜、锌等元素进行了测定，结果表明，该方法直接分析食品中微量元素具有操作简便，分析速度快，不需要化学预处理，以及可同时测定多元素等优点。
[关键词]药物分析；预处理方法；物理方法；化学方法
中图分类号：TU457文献标识码：A文章编号：1009-914X（2016）04-0341-01
所有的药物在批量生产和投入使用前，都是要先进行样品分析的，而在分析工作中有6层到8层工作都是要对样品进行预处理，尤其在大型分析仪器在医学上逐渐应用的情况下，分析工作中的预处理所占的比例也就越大。对药品进行分析测试的时候，还要的保证样品的正确性，这样才能对分析的结果有所保证，才能将分析的误差减小。所以，预处理方法的选择和研究是药物分析中最热的一个课题。
一、物理法预处理方法
1、萃取法
在一百多年以前，就已经有人应用了萃取法，通过乙酸乙酯等溶剂对水溶液中所含的乙酸进行萃取分离，这种方法应用后的不久，就已经有石油工业也采用了这种溶剂萃取法，从这可以看出，溶剂萃取技术在很久之前就已经被人们所用，并在工业上得到了发展。但是在溶剂萃取法中也有一定的弊端，就是要进行多次萃取，使用的有机溶剂量很大，造成了严重的污染，而且萃取体系也容易发生乳化，不能完全进行分离，也没有较高的定量分析回收率，在萃取时所使用的玻璃器皿也容易碎，价格还很昂贵，投入的成本过大。对中药样品中所含的非极性成分进行提取的时候，通常都是要先用极性溶剂尽心提取，然后才可以利用非极性溶剂进行反萃取，整个萃取的过程非常繁琐，如果小的失误将会造成严重损失。人们在萃取法的基础上又研究出新型的萃取技术，能有效降低成本，还不会有更多的毒害，萃取过程更加安全。
（1）超临界萃取
这是一种新兴的分离技术，又称为压力流体萃取、超临界气体萃取、临界溶剂萃取等等。超临界萃取利用超临界流体作为萃取剂，从液体和固体中提取出某种高沸点的成分，以达到分离或提纯的目的。
（2）液液微萃取
液液微萃取是采取一个体积很小的萃取剂液滴（常用的萃取剂体积仅为1L左右）或是在多孔小管中注入萃取剂对体系进行萃取。萃取剂可采用普通的有机溶剂，也可以采用离子液体，由于萃取剂用量极小，因此污染极小，故而成为颇受人们重视的一种新型萃取技术。
（3）固相萃取
固相萃取法是一种根据被萃取组分与样AGG基质及其他成分在固定相填料上作用力强弱的不同，使之彼此分离的技术。首先用适当的溶剂将固相萃取吸附剂润湿，然后加入一定体积的被处理样品溶液，使其完全通过吸附剂，让溶液中被测组分保留在吸附剂上，而大量的溶剂和其他不易保留在固相萃取吸附剂上的组分完全流出，再加入适当的洗涤剂从固相萃取吸附剂上除去其他不需要的组分，最后用洗脱液把保留在固相萃取吸附剂上需要测定的组分洗脱下来，直接供测定使用。固相萃取柱及固相萃取装置逐渐成为一种常用的样品预处理方法，在许多分析方法中已经替代了传统的液液萃取。特别是在药物分析中，因其有着良好的分离、净化和浓缩的能力，能够减少背景干扰，有相当高的应用价值。但固相萃取装置价格昂贵，一般在万元以上，条件较差的实验室无法负担，固相萃取柱通常都是一次性使用，故而成本甚高，不利于推广使用。
2、超声波预处理法
所谓超声波，就是声波的振动频率都是在20kHz以上，每秒也有很高的振动次数，已经完全超出了正常人耳的听觉上限，对于这种人们不能听见的声波，就被称之为超声波。在本质上，这种超声波与可闻的声波是一样的，都是属于机械式振动，也都是以纵波方式存在，并在弹性的介质内传播，完全属于能量的传播形式，这两者的不同之处在于超声波的频率很高，波长也比较短，在特低的距离内会有很好的直线传播能力，其方向性还有束射性都是比较好的，传播的时候也有较好的方向性，还有较强的穿透性和功率。传播在液体介质中的时候，它会让液体流动，并有数万个小的气泡产生，在超声波的纵向传播区域中，这些小的气泡会形成一个负压区，并在其中生长，然后在正压区还会迅速地闭合，这样就会在液体界面中有强烈冲击力产生，还会有空化现象出现。在药物分析的预处理过程中，可以利用超声波对药物样品进行清洗、活化，以及萃取分离，还可以对样品进行洗脱、消解等处理，在反应催化中也是可以利用的。
3、微波预处理法
电磁波的频率在300MHz到300000Mhz的范围内就形成了微波，通常情况下，家用的微波炉和工业用的微波炉，选定的频率都是在2450MHz左右。在过强的微波场中，会有大量得液态极性分子产生，这些分子以高速的运动形态对正负方向进行改变，其速度已经高达了每秒25亿次左右，而且分子间在运动过程中还有产生激烈的摩擦和碰撞，这样就会有高热量现象产生。在微波场作用之下，离解物质还会带动离子发生定向流动，从而形成了离子电流，在整个离子流动的过程中，它会和周围的离子以及分子发生碰撞，或者高速地摩擦，这样也就能能微波进一步转变成热能。微波加热就是通过分子极化和离子导电两个效应对物质直接加热的。它消除了一般加热过程中由于电热板、空气、容器壁的热传导和热辐射造成的热量损失，因而热效率特别高。目前，微波己经广泛的用于样品的干燥、溶解、消化、蒸馏、萃取、解吸等预处理过程，并获得了良好的效果，特别是对于药物、环境样品和天然产物，其应用更加广泛。微波也能对反应（包括无机反应和有机反应）起到催化作用。
二、化学法预处理
在化学法中主要应用的就是化学衍生法，主要指借助化学反应将待测组份接上某种特定基团，从而改善其检测灵敏度和分离效果的方法。利用化学衍生反应达到改变化合物特性的目的，使其更适合于特定分析的过程，在仪器分析中被广泛应用。一般化学衍生法主要有以下几个目的：提高样品检测的灵敏度；改善样品混合物的分离度；适合于进一步做结构鉴定，如质谱、红外或核磁共振等。进行化学衍生反应应该满足如下要求：对反应条件要求不苛刻，且能迅速、定量地进行；对样品中的某个组份只生成一种衍生物，反应副产物及过量的衍生试剂不于扰被测样品的分离和检测；化学衍生试剂方便易得，通用性好。衍生化常用的反应有酷化、酞化、烷基化、硅烷化、硼烷化、环化和离子化等。除了化学衍生法属于化学法预处理，一些界面化学反应，也会发生在液液萃取时形成的两相界面上，但是在实际应用中，并不是特别适用，本文也就不做过分研究和分析。
三、结束语
在药物实际的分析中，对样品进行预处理方法的选择还是依据药物具体的药理和药性，并注意药物样品的选择，要确保其正确性才能提高预处理的结果。在目前的预处理方法中，对物理和化学法还是要进行不断的创新和研究，力求在药物分析的预处理中能将分析的成本降低，并节约分析的时间，从而使检测灵敏度也大大增加。
参考文献
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关键词：重金属污染；土壤微生物；微生物多样性；研究方法
中图分类号X172文献标识码A文章编号1007-7731（2017）13-0036-03
StudyonSoilMicrobialDiversityinHeavyMetalContaminatedSoil
LiYan1etal.
（1AnhuiHuajingResourcesandEnvironmentTechnologyCo.，Ltd.，Hefei230094，China）
Abstract：Inthispaper，theresearchmethodsofmicrobialdiversityofheavymetalcontaminatedsoilsinrecentyearsaresummarized，andtheiradvantagesanddisadvantagesandtheirapplicationareanalyzed.Theresearchmethodsofmicrobesarealsodiscussed.
Keywords：Heavymetalpollution；Soilmicrobes；Microbialdiversity；Researchmethods
近年来，由于农药、化肥的大量使用，以及冶金、采矿业的迅猛发展，土壤重金属污染日趋严重[1]。重金属污染不仅会严重影响农产品以及农作物的品质，而且会通过食物链进入人体，危害人体健康。土壤是微生物栖息的最重要环境之一，提供了微生物生长所必要的营养物质。土壤微生物种类十分丰富，主要分为细菌、真菌、古菌以及放线菌等。土壤微生物是土壤有机质以及土壤养分C、N、P、S等循环转化的动力，参与土壤中有机质的分解、腐殖质的形成、土壤养分的转化循环等[2]。土壤微生物在土壤生态系统中扮演者十分重要的角色[3]，对环境的变化反应灵敏[4]，其群落多样性和相对组成，是评价环境质量的重要参数[5]。一旦土壤生态系统受到污染，土壤微生物就会发生相应的变化[6]。有研究报告指出，土壤重金属污染能明显影响土壤微生物的活性及结构[7]，李晶等[8]研究也表明，土壤微生物对重金属胁迫特别敏感，可通过微生物群落结构的变化来反映土壤质量和健康状况[9]。因此，研究土壤微生物具有十分重要的意义。本文对研究微生物传统以及各种新型研究方法进行了分类介绍，并对各种方法的优缺点以及适用场合进行说明。
1土壤微生物研究方法
1.1传统的分离纯培养和稀释平板计数在固体琼脂培养基上接种培养微生物，可利用微生物的表面特征差异，在固体培养基上对微生物进行分离纯化，也可利用该方法对微生物在平板上进行简单的计数[10]。同时可以通过配制不同成分的培养基对微生物进行筛选驯化，从而得到我们需要的菌种。此种方法的优点是成本低，便于对微生物的状况做出初步的判断。缺点是由于自然界中存在大量的不可培养的微生物，且存在很多对温度要求苛刻并微生物，如嗜低温菌和嗜高温菌，传统的固体培养基的培养温度并不能满足这些微生物的生存所需温度。
1.2Biolog微平板法Biolog微平板原理是基于测定微生物对单一碳源利用程度的差异来表征微生物的生理特性[11]。Biolog微平板由对照孔和95种不同单一碳源孔组成并在其中添加染料，当接种纯培养的菌液时，其中一些孔的营养物质被利用，使各孔呈现出不同的颜色，从而形成微生物特有的代谢指纹，可通过与标准菌种的数据库做对比，从而可鉴定出被测菌种。与传统培养方法相比，此方法可以估算微生物群落代谢多样性和功能多样性。同时可根据各孔的颜色差异来反映出微生物群落的均匀度，从而可以反映出群落的稳定性[12]。该方法的缺点是当环境差异不大时，这些指数并不能较敏感地区分菌群之间的差异[13]。同时由于不同的生长和竞争的结果，菌种之间会相互影响导致种群发生变化，影响测定结果[14]。
1.3磷酸脂肪酸分析法（PLFA）磷酸脂肪酸存在于活细胞的细胞膜中，具有属的特异性，不同属的微生物通过不同生化途径而形成不同的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。因此，土壤中的PLFAs组成和含量变化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的动态变化。通过对微生物的磷酸脂肪酸进行提取，并依据其中的特征脂肪酸指示的微生物种类[16]，可对土壤中微生物群落特征进行表征。此种方法具有对试验条件要求低、无需对微生物进行培养、测试功能多和稳定性好等优点[17]。但PLFA法也具有一定的局限性。该方法只能鉴定到属，PLFA图谱并不能给出一个实际的微生物种类组成，仅能反映微生物群落的概图[18]；另外，该方法容易受微生物生理状态影响[19-20]；古菌不能使用PLFA图谱进行分析，因为它的极性脂质是以醚而不是以酯键的形式出现[21]。同时由于目前尚未建立土样中所有微生物的特征脂肪酸，并且在很多情况下，还无法确定土样中某些脂肪酸与特定微生物或微生物群落的对应关系[22]。
1.4变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）该技术是以复杂的环境样品如土壤为研究对象，直接提取微生物DNA，利用通用引物进一步对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增产物开展DGGE凝胶电泳分析[23]。DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开[24]。该方法的原理是根据DNA的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所需要的变性剂浓度不同。在普通的聚丙烯酰胺凝胶基础上加入变性剂，根据其迁移行为决定于其分子大小和电荷的原理能够将长度相同但序列不同的DN段区分开[25]。该方法具有可靠性高、重现性强、方便快捷、分辨率高等优点[26]，但同时也存在一定的局限性。DGGE还不能全面分析土壤中全部微生物，该方法只能检测出土壤中相对丰度大于1%的微生物[27]；同时DGGE对实验要求较高，凝胶浓度、温度、电压等电泳条件选择不当时，就会发生共迁现象[26]，即同一条带不止包含一种微生物，微生物的种类被低估。
1.5高通量测序技术高通量测序技术也称“下一代”测序技术，1次并行能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技术为代表[28-29]。该技术对于研究土壤微生物具有极大的意义。该技术极大地降低了微生物测序成本，实验了大规模土壤微生物直接测序[30]；同时该方法极大地提高了测序通量，丰富了研究的信息量，便于研究者更加深入地了解所研究课题。但同时该方法也存在一定的局限性，主要局限性如下：海量数据分析难的问题，该测序方法所测数据之深，所获信息之大，都极大地加大了实验研究者分析数据的难度；数据去伪存真难的问题，在土壤微生物高通量测序中，存在物种丰富度被高估的情况[30]，对高通量测序结果去伪存真，探索新的统计学方法成为研究者面临的一大难题[31]。
1.6基因芯片技术（GeoChip）基因芯片（GeoChip）是研究土壤微生物非常有效的技术手段，作为新一代的核酸杂交技术，可用于检测环境微生物参与物质循环、污染物降解等过程中参与的功能基因[32]。该方法是在芯片上含有编码各种与生态学和生物功能过程或生物降解作用有关酶的基因[33]。由此可见，功能基因芯片为土壤微生物研究提供了全新有力的技术分析工具，有利于更加有效地利用微生物对污染土壤进行修复[34]。基因芯片技术具有高密度、高灵敏度、自动化和低背景水平等显著优点[35]。但是任何技术都存在一定的局限性，基因芯片技术也不例外。该技术虽能检测出微生物在生物学过程中所发挥作用的功能基因，但是却不能直接表征微生物的群落多样性组成和丰富度。应结合DNA与mRNA测序，可以更加真实全面地反映土壤微生物群落结构信息及其生理活动[34]。同时该方法在取样、标记、杂交条件、图像处理、数据归一化以及所得数据的质量评估等都会带来很多误差[36]。
2不同方法在重金属污染土壤中的应用
刘云国等[37]在湖南临乡桃林矿区土壤中采用稀释涂布法在马丁固体培养基上筛选出一株高抗铜、锌菌株；张秀等[38]利用Biolog微平板法来分析生物质炭对镉污染土壤微生物多样性的影响；孙婷婷等[39]利用磷酸脂肪酸分析法来分析羟基磷灰石-植物联合修复对Cu/Cd污染植物根际土壤微生物群落的影响；郑涵等[40]利用PCR-DGGE分析方法对锌胁迫对土壤中微生物群落变化的影响进行了评价分析；江玉梅等[41]利用Illumina平台高通量测序技术分析重金属污染对鄱阳湖底泥微生物群落结构的影响；路桃香对植物非根际土壤微生物进行454高通量测序。
目前对于微生物研究方法有很多种，有最先进的技术，也有传统的实验方法，每种方法都各有优缺点，因此，在研究土壤微生物时，应结合土壤特征以及研究目的合理选择研究方法。如条件允许的情况下，可以结合多种技术方法同时使用，可以更好地研究土壤微生物的群落特征。
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关键词：陈化烟叶；寡营养菌；细菌多样性；16SrDNA序列；聚类分析
中图分类号：TS41+4文献标识码：A文章编号：0439-8114（2013）06-1292-06
烟叶在制成成烟之前需要经过漫长的陈化期，烟叶陈化是卷烟工业的一种初加工方法。当年收获的新烟叶，其品质都存在不同程度的缺陷，不宜直接用于制造卷烟，必须进行陈化处理[1]。在陈化发酵过程中，烟叶主要化学成分发生变化，青、杂气和刺激性大大减轻，香气显露，气味醇和，色泽均匀并加深[2]。烟叶表面的微生物发酵作用，对烟叶的陈化起着重要的作用。新烟叶在经过漫长的陈化阶段后，烟叶的品质进一步得到改善，有害物质的含量也随着降低。这个时期一般需要2～3年，如何缩短这个时期一直是科研工作者的研究热点[1，3-5]。
烟叶表面含有丰富的微生物已有大量研究报道，如Zhao等[6]通过非纯培养的方法对多种不同陈化时期的烟叶表面微生物进行了研究，采用16SrDNAPCR-DGGE技术进行多样性分析发现，早期陈化阶段各种烟叶拥有相似的优势微生物种群结构，主要有5种细菌，其中3种为未培养微生物。Huang等[7]通过RLFP技术构建OTUs（Operationaltaxonomicunits）克隆文库比较陈化与非陈化烟叶细菌多样性发现，在陈化的烟叶中存在大量的未培养微生物。韩锦峰等[8]通过对未发酵、自然陈化及人工发酵期间的烤烟叶面微生物进行分离、鉴定，并对不同发酵时期微生物进行动态研究，结果表明，未发酵烤烟叶面微生物数量最多，但是随着自然陈化及人工发酵的进行，叶面微生物数量均逐渐减少，且以芽孢杆菌属（Bacillus）和梭状芽孢杆菌属（Clostridium）为优势种群。朱大恒等[9]研究也发现烤烟中以芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌为优势种群。而且大量研究表明烤烟叶面微生物中，细菌占绝对优势，放线菌和霉菌较少，细菌中以芽孢杆菌属为优势菌群，霉菌中以曲霉为优势菌群。优良品种烤烟叶面微生物的数量较大，种类也较多。因此研究不同烟草表面的微生物多样性具有重要意义。
寡营养菌概念提出时没有特指哪一类的微生物[10]。直到1979年，Kuznetsov等[11]才提出了寡营养菌是特指那些第一次培养时可以在含碳浓度为1～15mg/L培养基中生长的细菌，并把它分为两类，一类为在寡营养和富营养条件下均能生长的细菌，称为兼性寡营养菌；另一类为只能在寡营养培养基中生长的细菌，称为专性寡营养菌。科研工作者现在已经从多种生境中分离到了寡营养菌，它广泛存在于海洋、湖泊、河流、土壤甚至饮用水中。Arthur[12]指出了寡营养菌营养偏好的原因，Button等[13]则研究了它对营养物质利用的动力学机制，发现寡营养菌的米氏常数较低，对营养物质的亲和力大于富营养菌，因而在寡营养条件下能够获得竞争优势。国内关于寡营养菌的研究起步晚，报道得也少。潘惠霞等[14]通过分离新疆沙漠中寡营养菌并对其在防风固沙方面进行研究发现，一些寡营养菌产生的胞外多糖能够对沙粒产生粘连作用。和振花等[15]对极地海水中寡营养菌多样性进行了研究。
目前尚没有研究烟叶中寡营养菌的报道，根据以往关于陈化烟叶表面微生物分离和多样性的报道推测，在漫长的陈化过程中，尤其是对于烟草品质提升有关键作用的中后期，可利用的简单营养物质几乎消耗殆尽，大部分菌株死亡，只有寡营养菌株才有可能生长。随着陈化时间的延长，烟草的等级就越高，品质就越好，最后起作用的主要是寡营养菌。因此，研究陈化烟叶中寡营养菌的多样性，对于解释传统的陈化作用如何利用微生物来改善烟叶品质有着十分重要的意义。此次试验尝试利用寡营养培养基对陈化烟叶表面的可培养寡营养菌进行分离和多样性研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1烟叶样品2010年的广西百色烤烟K326C3F等级，湖北恩施烤烟云85C3F等级，湖北恩施烤烟云85B3F等级，湖北宜昌马里兰烟马里兰1号中部一级。
1.1.2培养基DNG固体培养基：TSB15mg，去离子水100mL，pH7.0，121℃灭菌30min。DNG液体培养基：TSB15mg，Gellanagar1.5g，CaCl2溶液37.5μmol/L，去离子水100mL，pH7.0，121℃灭菌30min。LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉15g/L。
1.2方法
1.2.1材料的预处理取适量的烟叶在无菌条件下剪碎，用100mL去离子水浸泡10min，在摇床上200r/min振荡20min。利用无菌纱布过滤，取滤液，然后离心去上清，用1mL无菌水重悬。
1.2.2陈化烟叶中菌株的分离与筛选取100μL滤液进行10倍梯度稀释，稀释液涂布DNG固体平板，并用封口膜或者一次性PE手套密封，于25℃培养2～4周，每隔3d观察1次，将获得的单菌落进行分区划线进一步分离与纯化。将已获得纯培养的菌株接种于LB固体培养基中，观察菌落的生长状态。
1.2.3陈化烟叶中分离菌株的16SrDNA分子鉴定提取已获得纯培养菌株的总DNA[16]，采用16SrDNA通用引物[17]进行PCR扩增，正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物为1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。按如下条件进行PCR扩增：94℃、5min；94℃、30s，54℃、30s，72℃、90s，30个循环；72℃、7min。PCR产物采用凝胶纯化试剂盒纯化，纯化步骤参照试剂盒说明书进行。纯化的PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，测序结果进行BLAST同源比对。
1.2.4不同烟叶分离寡营养菌的系统聚类分析将每种烟叶所分离寡营养菌的16SrDNA序列进行BLAST比对分析，挑选每个菌株最大一致性的同源菌株的16SrDNA序列一起利用软件ClustalW2.0和MEGA5.1进行聚类分析，构建系统进化树。
1.2.5专性寡营养菌的鉴别将筛选出的菌株再次在富营养培养基中培养，不能生长的为专性寡营养菌；能生长的菌株，为了排除污染的可能性，将可以生长的菌株进一步用寡营养培养基培养，能在寡营养培养基生长的为兼性寡营养菌。
2结果与分析
2.1广西百色烤烟K326C3F等级可培养寡营养菌的分离与16SrDNA系统进化分析
通过利用寡营养和长期培养的方法，从该烟叶中共分离出12株菌株，具体见表1。利用ClustalW2.0和MEGA5.1进行聚类分析，构建系统进化树如图1所示。从图1可以看出，在C3F等级陈化烟叶中一共存在10个菌属，它们分别为泛菌属（Pantoea）、假单胞菌属（Pseudomonas）、微杆菌属（Microbacterium）、古氏库特菌属（Kurthiagibsonii）、不动杆菌属（Acinetobacter）、副球菌属（Paracoccus）、法氏沃氏菌属（Wautersiellafalsenii）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、微球菌属（Micrococcus）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）。通过1.2.5的方法发现菌株C3F18只能在寡营养培养基生长，由此可以看出在此种陈化烟叶中只有C3F18为可培养的专性寡营养菌，其他菌株均为兼性寡营养菌株。
2.2湖北恩施烤烟云85C3F等级可培养寡营养菌的分离与16SrDNA系统进化分析
通过利用寡营养和长期培养的方法，从该烟叶中共分离出10株菌株，具体见表2。利用ClustalW2.0和MEGA5.1进行聚类分析，构建系统进化树如图2所示。从图2可以看出，在恩施云85C3F等级陈化烟叶中一共存在7个菌属，分别为假单胞菌属、古氏库特菌属、微小杆菌属、微球菌属、类芽孢杆菌属、不动杆菌属和芽孢杆菌属。C3FN7和C3FN18只能在寡营养培养基中生长，由此可以看出在此种陈化烟叶中只有C3FN7和C3FN18为可培养的专性寡营养菌，其他的菌株均为兼性寡营养菌株。
2.3湖北恩施烤烟云85B3F等级可培养寡营养菌的分离与16SrDNA系统进化分析
通过利用寡营养和长期培养的方法，从该烟叶中共分离出15株菌株，具体见表3。利用ClustalW2.0和MEGA5.1进行聚类分析，构建系统进化树如图3所示。从图3可以看出，该种陈化烟叶中一共存在10个属，分别为副球菌属、微球菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、肠杆菌属（Enterobacter）、节杆菌属（Brevibacterium）、欧文氏菌属（Erwinia）、盖球菌属（Kytococcus）、短小芽孢杆菌属（Bacilluspumilus）以及泛菌属。分离的菌株都能在富营养培养基上生长，可见从此种烟草中分离的均为兼性寡营养菌。
2.4湖北宜昌马里兰烟马里兰1号中部一级可培养寡营养菌的分离与16SrDNA系统进化分析
通过利用寡营养和长期培养的方法，从该烟叶中共分离出18株菌株，具体见表4。利用ClustalW2.0和MEGA5.1进行聚类分析，构建系统进化树如图4所示。从图4进化树中可以看出，该种陈化烟叶中一共存在10个属，它们分别为假单胞菌属、短波单胞菌属（Brevundimonas）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、法氏沃氏菌属、副球菌属、微球菌属、盖球菌属、考克氏菌属（Kocuria）、鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）、类香菌属（Myroides）。菌株M10和M32只能在寡营养培养基中生长，由此可以看出在此种陈化烟叶中有2种可培养的专性寡营养菌。
3讨论
由于寡营养菌独特的生态功能，对于减少烟叶中有害物质，提高烟叶的经济价值，增加烟农收入，改善烟草存储条件，改善吸烟者的健康状况都有重要的意义。通过分离这4种烟叶的寡营养菌，结合烟叶本身的特色，发现微生物的多样性和烟叶的品种和质量有一定的内在联系，例如湖北恩施烤烟云85中的B3F和C3F两个等级烟叶中的Kytococcusschroeteri和Bacilluspumilus以及Enterobacteriaceaebacterium为湖北恩施烤烟云85中独特的微生物，又因为B3F的物质含量多些，对应的微生物种类也相应多些。而4种烟叶中由于马里兰烟叶与其他烤烟烟叶有着明显不同，微生物种类一是数量上多于其他三类，种类上也和其他三类差异很大，这一是因为马里兰烟叶本身的香气物质不一样，物质种类有差异，物质分解后产物也有差异，二是马里兰烟叶在凉棚中晾制，产生微生物也会更多。
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关键词：环境保护；污染治理；宏基因组技术；实践应用
前言：工业化进程的加快，带来了比较严重的环境污染问题，不仅影响了经济的可持续发展，还给人们的健康造成了很大的威胁，因此，做好环境保护和污染治理工作，是可持续发展理念下社会各界普遍关注的问题。利用宏基因组技术，开展环境保护和污染修复，能够取得良好的效果，而且不会对环境产生二次破坏。
1宏基因组技术概述
宏基因组的概念最早出现了1998年，用以定义土壤细菌的混合基因组，经过了十数年的发展和演变，现在的宏基因组指的是环境中全部微生物遗传物质的综合，也称环境基因组或者元基因组。宏基因组的主要研究流程，是从自然环境中会，直接提取总DNA，经纯化及部分酶切后，接入到合适的载体中，确保其能够在适当的环境下转化为宿主菌，进而形成全新的DNA文库，结合功能检索和序列分析等，可以针对获得的克隆子进行筛选，得到目的产物。这里针对其主要流程进行简单分析[1]。
（1）环境样本提取：环境样本的质量是宏基因组技术应用的关键所在，在环境样本中，存在大量的有机和无极颗粒，微生物占据的比例很小，而且其一般都是与颗粒紧密依附，想要在充分保证目的基因完整的前提下，完全提取样本中的DNA，对于相关技术有着极高的要求。在当前的技术条件下，比较常见的两种样品提取方法包括原味裂解法和异位裂解法。
（2）载体选择：载体的选择关系着基因组转入宿主细胞的效率和效果，一般常见的载体包括了有质粒、福斯黏粒、细菌人工染色体、哺乳动物人工染色体等，在进行选择的过程中，主要参照对象是目的基因的大小以及是否有利于实现目的基因的扩增和表达等。每一种载体都有着各自的优势和不足，在实际研究过程中，技术人员应该结合具体的需求，对载体进行合理选择。
（3）宿主菌选择：目的基因在连接载体之后，需要转化成宿主菌，然后才能够进行阳性克隆子的筛选工作，得到各种酶和生物活性物质，从这个角度分析，想要实现重组基因的高效克隆和表达，宿主菌的选择是非常重要的前提条件，在进行选择的过程中，必须考虑转化效率、稳定性以及载体在宿主菌中的表达性等。
（4）宏基因组文库筛选：宏基因组文库的构建，主要目的是从中获取丰富的基因资源，实现对于生物活性物质的挖掘。不过，在环境样品中，微生物的种类极其繁杂，文库的容量巨大，如何对功能基因进行有效筛选，是研究人员必须深入探索的问题。就目前来看，经过长期的发展，宏基因组文库的筛选方案有几种，包括序列驱动筛选、功能驱动筛选、底物诱导基因表达筛选以及化合物结构筛选等。如果想要获取更多的信息，可以同时应用多种筛选方法，通过优势互补，提升宏基因组文库的筛选效率[2]。
2宏基因组技术在环境保护和污染治理中的应用
对于环境的保护和污染的治理，一直都是社会各界普遍关注的问题，最近几年，伴随着微生物学的发展，生物修复技术逐渐成为了污染修复的热门技术，主要是利用细菌、真菌以及一些微生物、植物等，通过自然代谢，对环境中的污染物进行清除，利用生物的分解能力，实现污染修复的目的。
2.1降解基因及功能菌株的挖掘
相关研究表明，在环境中可供培养的微生物仅仅占据为微生物总量的1%-10%，而仅仅依照这些资源来对新的物种和基因进行发掘，显然是远远不够的。结合宏基因组技术，可以从环境样本中进行基因组DNA的提取和克隆，从而实现了直接从自然界获取遗传信息，因此理论上能够获取任意序列的基因，既可以借此发现新物种，也可以合成新的物质。从这个角度分析，在环境保护和污染治理中应用宏基因组技术，具有较高的可行性。
很多环境污染，尤其是水体污染，温度相对较低，并不适合常规微生物的生存，传统的生物修复技术无法起到良好的效果。应用宏基因组技术，可以筛选出一些在低温条件下具备良好生存能力和生物活性的微生物，实现污染的治理和修复，如海洋石油降解、重金属低温修复等。同样，在高温、酸碱等极端环境中，宏基因组技术的应用同样能够起到良好的污染修复效果。就目前而言，在环境科学领域，遗传工程是最活跃一个分支，可以将宏基因组中分离出的基因元件组编织成具备降解污染物功能的基因簇，取代原本的化工物，或者直接针对环境中的污染物质进行降解。必须注意一点，基因工程菌在实际应用前，需要做好功能稳定性、遗传稳定性以及生态安全性的检验，确认无误后才能用于污染治理[3]。
2.2生物种群多样性的分析
在全球环境变化研究中，生物的多样性和变化性一直都是备受关注的课题，针对微生物种群的多样性及相关群落结构进行研究，是现代环境监测与评价的一个重要手段。宏基因组技术的应用，能够帮助研究人员充分了解环境样品中微生物的多样性，结合其中的总DNA提取方法，可以了解微生物与被污染环境的互作关系，明确污染程度，实现对于环境的监控和评价。例如，Treusch等研究人员从森林土壤以及沙地生态系统中提取DNA，构建出了3个大片段Fosmid基因文库，对古细菌多样性进行了明确揭示；黄立南等人采用扩展性rDNA限制性酶切片段分析法，针对广州市北郊的李坑垃圾填埋场渗滤液中存在的古细菌群落进行了研究和分析，从中初步获取了垃圾填埋内部古细菌群落的结构和多样性的信息。
伴随着研究的不断深入，证实了环境的变化会对生物物种产生影响，同时，处于隔离状态的单一物种会主动对环境变化作出响应，不过其与存在各类互作关系时的结果有着很大的差异性。只有在基因组水平上，对环境胁迫银族以及微生物群落的组成关系进行深入研究，才能对生物、环境以及生态之间的相互关系进行明确，了解其动态变化，为环境的保护、检测、预警、评价及治理提供可靠依据[4]。
3结语
总而言之，利用宏基因组技术，可以获取生物多样性的相关信息，这些信息在环境监测和评价中发挥着重要作用，不过，考虑到宏基因组技术研究实践尚短，存在着大量亟待解决的技术难题，加上其本身的研究涉及范围光、工程量巨大，应该对各种资源进行整合，构建环境样品宏基因组共享数据库，推动多个学科的交叉融合，使得宏基因组技术在环境保护和污染治理方面的作用能够得到最大限度的发展。
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关键词农药残留;检测;样品前处理
中图分类号O69文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)032-0115-01
1概述
农药是当前农业生产用于防治病、虫、杂草对农作物危害不可缺少的物质,对促进农业增产有极重要的作用。随着农业科学技术的发展,化学农药的品种和数量不断增加,已成为防治病虫害的主要手段。农药施用到农作物上以后,绝大部分因多种原因而转化,但作物内会残留有极少量的农药。长时间摄食残留农药会影响人体的健康,这就是农药残留量问题的由来。为保障我国人民的身体健康、有效控制农药在茶叶、粮谷、蔬菜和水果等生产中的合理使用和对其残留量进行监控,满足进出口贸易的需要,大力开展农药残留量检测技术以及相关的前处理技术的研究是非常必要的。化学农药是一类复杂的有机化合物,根据其用途可以分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂、杀螨剂、杀鼠剂、杀线虫剂。根据化学结构又可分为有机氯、有机磷、拟除虫菊酯杀虫剂,取代氯苯氧基酸或酯除草剂,氨基甲酸酯杀虫剂、除草剂和杀菌剂和有机杂环类杀菌剂、除草剂等。
为了运用先进的技术和设备,对农药残留进行检测分析,必须对样品进行科学的前处理,目前较先进的前处理技术已经得到了较好的应用。
2前处理技术
2.1固相萃取(SolidPhaseExtractionSPE)
固相萃取(SPE)就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附,与样品的基体和干扰化合物分离,然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附,达到分离和富集目标化合物的目的。与液/液萃取相比固相萃取有很多优点:固相萃取不需要大量互不相溶的溶剂,处理过程中不会产生乳化现象,它采用高效、高选择性的吸附剂(固定相),能显著减少溶剂的用量,简化样品的予处理过程,同时所需费用也有所减少。一般说来固相萃取所需时间为液/液萃取的1/2,而费用为液/液萃取的1/5。但其缺点是目标化合物的回收率和精密度要略低于液/液萃取。固相萃取实质上是一种液相色谱分离,其主要分离模式也与液相色谱相同,可分为正相(吸附剂极性大于洗脱液极性),反相(吸附剂极性小于洗脱液极性),离子交换和吸附。固相萃取所用的吸附剂也与液相色谱常用的固定相相同,只是在粒度上有所区别。固相萃取选择分离模式和吸附剂时还要考虑以下几点:
1)目标化合物有极性或非极性溶剂中的溶解度,这主要涉及淋洗液的选择。
2)目标化合物有无可能离子化(可用调节PH值实现离子化),从而决定是否采用离子交换固相萃取。
3)目标化合物有无可能与吸附剂形成共价键,如形成共价键,在洗脱时可能会遇到麻烦。
4)非目标化合物与目标化合物在吸附剂上吸附点的竞争程度,这关系到目标化合物与干扰化合物能否很好分离。
2.2固相微萃取(SPME)
固相微萃取(SPME)是在固相萃取上发展起来的一种新型、高效的样品预处理技术,它集采集、浓缩于一体,简单、方便、无溶剂,不会造成二次污染,是一种有利于环保的很有应用前景的预处理方法。与液/液萃取和固相萃取相比,具有操作时间短,样品量小,无需萃取溶剂,适用于分析挥发性与非挥发性物质,重现性好等优点。很多研究结果表明,在样品中加入适当的内标进行定量分析时,其重现性和精密度都非常好。
固相微萃取技术包括两个过程:①样品中待分析物在石英纤维上的涂层与样品间扩散、吸附、浓缩过程以及浓缩的待分析物脱附进入分析仪器完成分析过程。在前一个过程中,涂有吸附剂的石英纤维浸入样品中,使样品中目标化合物从样品基质可中扩散、萃取、浓缩于涂层上。②将石英丝收回针头中,进样时直接插入分析仪器的进样室中,如气相色谱仪的汽化室,使萃取的化合物脱附,被载气导入色谱柱完成分离分析。在实施固相微萃取时可以采用直接固相微萃取法、液上空间固相微萃取法和衍生化固相微萃取法3种模式。影响固相微萃取灵敏度的因素很多,但萃取头涂层种类和厚度对灵敏度的影响最为关键。一般来说,不同种类待测物要用不同类型的吸附质涂层进行萃取,其选择基本原则是“相似相溶原理”。用极性涂层萃取极性化合物,用非极性涂层萃取非极性化合物。
2.3微波萃取技术(MAE)
微波萃取就是利用极性分子可迅速吸收微波能量来加热一些具有极性的溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮和水等。因非极性溶剂不能吸收微波能量,所以在微波萃取中不能使用100%的非极性溶剂作为萃取溶剂。一般可在非极性溶剂中加入一定比例的极性溶剂来使用。如丙酮-环己烷(体积比=1:1)就可用来作微波萃取溶剂。微波萃取是将样品放在聚四氟乙烯材料制成的样品杯中,加入萃取溶剂后将样品杯放入密封好、耐高压又不吸收微波能量的萃取罐中。由于萃取罐是密封的,当萃取溶剂加热时,由于萃取溶剂的挥发使罐内压力增加。压力的增加使得萃取溶剂的沸点也大大增加,这样就提高了萃取温度。同时,由于密封,萃取溶剂也不会损失,也就减少了萃取溶剂的用量。微波萃取装置一般是一台带有控温和控时的微波加热装置,根据需要选用体积为50-100ml的聚四氟乙烯材料制成的样品杯和放样品杯的密封罐。影响微波萃取效果的主要因素有萃取温度、萃取溶剂、样品杯材料吸附及记忆效应等。
2.4加速溶剂萃取(ASE)
加速溶剂萃取(ASE)是一种全新的处理固体和半固体样品的方法,该法是在较高温度(50-200℃)和压力条件(10.3-20.6MPa)下,用有机溶剂萃取。它的突出优点是有机溶剂用量少(1g样品仅需1.5mL溶剂)、快速(一般为15min)和回收率高,已成为样品前处理最佳方式之一,已广泛用于环境、药物、食品和高聚物等样品的前处理,特别是农药残留量的分析。在高温下能加速溶质分子的解析动力学过程,减小解析过程所需的活化能,降低溶剂的粘度,因而减小溶剂进入样品基体的阻力,增加溶剂进入样品基体的扩散。
2.5凝胶渗透色谱(GPC)
凝胶渗透色谱技术被用来去除脂肪和其它分子量相对较高的化合物,适用的样品范围极广,回收的农药品种多,回收率也较高,不仅对油脂净化效果好,而且分析的重现性好,柱子可以重复使用,已成为农药多残留分析中的通用净化方法。其作用类似一组分子筛,将样品溶液加到柱子上后,用溶剂淋洗,分子量大于农药的类脂肪、色素、蜡质等先被淋洗出来,然后农药按分子量大小相继被淋洗出来。常用的淋洗剂有环己烷/二氯甲烷、甲苯/乙酸乙酯、二氯甲烷/丙酮等。
关键词：土壤微生物；环境胁迫；响应机制；农业发展；土壤肥力；农作物；种植产量文献标识码：A
中图分类号：S154文章编号：1009-2374（2017）11-0145-02DOI：10.13535/ki.11-4406/n.2017.11.074
1概述
地球表面最表层覆盖的是土壤，土壤不仅是自然资源中最与人接近的资源，还是分布量最大的资源，几乎在地表上到处都有土壤，可以说土壤与人类的生产生活紧密相连。同时，土壤作为大自然赋予的保护层，对维护自然生态系统的稳定性有重要意义，对此必须重视对土壤生态系统功能的养护，加强对破坏土壤营养成分的因素进行分析，以便提高土壤在环境中的抵抗力。众所周知，土壤生态系统自成一个完整的循环体，在土壤中生存了大量具有多样性特点的生物群落，正因为这些生物具备多样性特点，且含有对土壤起到积极影响的营养元素，才能维持土壤生态循环系统的平衡，并且部分微生物是参与地球化学循环必要物质，对植物生长、气候调节等陆地生态系统的生态功能起到不可替代作用。因此，探索微生物群落对环境的胁迫所引起的环境变化做出的响应，根据微生物响应机制做出调整，提高土壤自身生态功能的稳定性是十分必要的。
2土壤微生物与环境胁迫之间的联系
环境胁迫是指在自然界中，环境对其范围内存在的生物产生了一定程度的威胁和制约，破坏了生物的自然生长和存在，这种胁迫主要是受到外来因素的干扰，例如受到天灾冰冻、洪涝、盐碱等或者受到人为的干扰如倾倒垃圾、碾压等。土壤作为自然环境中四处存在的物质，其受到环境的影响作用十分V泛，并且长期以来，由于人类工业化发展和城市化的变革，给土壤生态环境造成了难以想象的破坏。
在环境给土壤造成的破坏之中，突出的土壤污染表现为土壤重金属沉积，大量重金属经过日积月累，会导致土壤的生态系统失去平衡，造成土壤中微生物群落活性降低，使微生物生长逐渐朝向单一化演变，最终导致土壤的机能下降。已知关于土壤微生物对环境胁迫的响应机制研究中，人们多数是将重金属污染作为研究生物和环境胁迫的切入点。目前，科研人员已经发现了重金属在土壤中的沉积，会对土壤内部微生物群落多样性以及土壤生态稳定性等多方面造成影响，从这个角度切入进行实验，可以获得多项研究结果，有利于科研对比实验的展开。
3土壤微生物多样性及土壤生态稳定性研究方法分析
3.1土壤微生物多样性研究
土壤微生物群落因为自身的物质特点具备多样性的性质，正是由于微生物群落的多样性，为土壤提供了充分的营养，能够维持土壤生态系统平衡。而要想探究土壤微生物对环境胁迫的影响机制，首先就要了解土壤微生物多样性，对土壤微生物多样性的掌握有利于提高人们认识微生物的生态功能。测量土壤微生物群落多样性主要利用培养方式进行实验，传统的测量方法有底物利用分析法、分离培养分析法，也有依靠新技术产生的新兴研究方法，比如说高通量同高分辨率结合的宏基因组学分析法。在研究过程中，根据所具备的实验条件选择恰当的实验方法，对土壤微生物群落多样性进行分析和记录，在反复比对实验数据后得出土壤微生物群落多样性特征。目前，实验研究人员会根据微生物群落多样性的差异做出区分，多以微生物群落α多样性、β多样性和γ多样性为研究内容。
3.2土壤生态稳定性研究
实际上，土壤生态稳定性决定了土壤在遇到环境胁迫时的响应机制反应度，土壤生态稳定性是指生态系统在面临外部环境发生变化，对土壤的各个方面的性能和生态性造成影响时，可以利用自身功能与性能抵抗外部侵袭的影响，使得土壤生态系统能够保持原有的状态。土壤生态稳定性包括了许多方面，但是起到绝大部分作用的有两个，即土壤抵抗力稳定性和恢复力稳定性。这两个功能是土壤本身含有的，不同的是不同的土壤因为具有的微生物群落不同，会体现出不同程度的差异。根据相关数据显示，土壤中的微生物群落如果功能性显示出多样化，并且微生物群落的数量越多，土壤自身的抵抗力稳定性和恢复力稳定性就越大，所以在研究土壤生态稳定性的实验中，研究人员主要讨论的就是这两个功能指标。
4土壤微生物对环境胁迫响应机制的分析
4.1土壤微生物群落功能冗余情况
功能冗余一般指具备多项功能的事物会存在生态功能重叠情况，对于土壤微生物群落而言，微生物具有多样性的特征，不同的微生物群落都会存在一些生态功能，这些功能本质上所起到的作用都是一致的。有实验证明，土壤微生物群落中的某些生态功能被剔除后，这些微生物群落的生态系统功能并没有发生太大改变，仍然可以维持原有的生态体系。也就是说，一旦土壤面对环境胁迫，微生物群落会选择脱离出一些个体，来应对环境变化造成的恶果，剩余微生物群落可能会减少微生物种类，使功能结构发生改变，但是这些改变还不足以支持整体土壤微生物群落的正常功能。众多数据显示出，土壤具备功能的稳定性，很大程度上与土壤微生物群落的功能冗余存在联系，正是因为这些功能冗余的原因，会始终保持土壤在自然环境的变化中呈现出平衡性，所以研究功能冗余的物种发挥重要作用可以很好的解释生态系统稳定性的潜在机理，对研究土壤生态系统平衡起到了重要的影响作用。自然微生物群落多样性与功能之间的联系始终都没有得到详细的认知，科学家们对微生物群落的研究体现在多方面，其中非常明确地表示出微生物群落的功能冗余对各种研究都有影响。
4.2土壤微生物对重金属污染的抵抗性能
当前，社会环境问题严重，给土壤的生态系统造成了严重威胁，除了人为的治理以外，土壤微生物群落在应对土壤环境恶劣情况中发挥了巨大作用。在研究土壤微生物群落对环境胁迫的响应机制过程中，人们着重关注了微生物群落对土壤中因重金属带来的环境变化进行抵抗并自我恢复的研究，经过多项实验观察，确定了微生物群落在面对重金属物质的胁迫时能够及时激发响应机制，助力土壤保持生态系统稳定平衡。当土壤微生物群落感受到重金属的威胁时，一般会采取自动应对机制，形成相应的能力。其一，当重金属物质入侵土壤后，土壤中的微生物群落会改变性质，由耐受型微生物群落逐渐取代敏感型；其二，当遇到重金属量过大时，土壤中的微生物群落会发生对这些重金属的水平转移，会逐渐在群落内部生成抗性基因，对抗重金属；其三，有可能在遇到重金属入侵时，土壤微生物群落发生物种遗传变异，从初始微生物群落开始逐渐产生的新的群落会具备这些抗金属性能。在对抗重金属入侵过程中，土壤中用以对抗重金属的微生物群落还是会受到影响，时间越长，这些对抗重金属的微生物群落对抗性能和恢复性能降低越快，在面对环境胁迫时，土壤生态系统的稳定性更多还是依靠耐受型微生物群落和抗性基因转移（水平转移）。
4.3环境胁迫下土壤微生物的其他机制
环境胁迫一旦发生，会引起原核生物与真核生物细胞产生蛋白质错误折叠与聚合。当环境胁迫为热胁迫，此时土壤微生物群落中的细菌会发生蛋白质变性与聚合，温度超过一定的限定值后会在原有细菌内部的蛋白质基础上诱变为热激蛋白，其内部含有分子伴侣，作用于细胞蛋白质，能够防止出现聚合或者降低蛋白质错误折叠，并且在热激蛋白中存在一种非蛋白酶，这种酶的作用是降解不可逆损坏的多肽。
5结语
总之，当土壤遭遇环境胁迫时，土壤微生物群落会依靠自身的生态功能引发响应机制，应对已经发生的环境胁迫。但是单靠土壤微生物自发性的响应机制仍然不够，随着社会环保观念的加强，要持续加大投入研究土壤微生物对环境发生胁迫时响应机制的内容。就我国当前的实际情况而言，更要注重对土壤中的重金属抗性基因转移（水平转移）做深入研究，找出科学方法提高土壤微生物群落的生态活性，加强土壤微生物群落对重金属的抗性，以便提高土壤肥力，为恢复土壤生产力奠定坚实基础。
参考文献
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关键词：硝化菌群；分子生物技术；荧光原位杂交
分子生物技术的应用对于污水生物处理带来了一定的帮助，是现阶段应用比较普遍的一项技术手段，在进行污水生物处理的过程中，主要包含两个阶段，一个阶段是硝化，一个阶段是反硝化，这两个阶段都是脱氮的主要环节，在硝化过程中，主要的微生物是硝化菌群，其中包含了众多的微生物离子，在污水生物处理的过程中，主要依靠了生物活性以及稳定的菌群分布两个主要特点，这样才能促进污水生物系统中脱氮更加稳定的运行。在应用分子生物技术处理污水中硝化菌群的过程中，已经有相关研究项目对此展开了详细的分析，本文主要对此加以论述，希望对今后的研究工作带来一定的帮助。
1基于FISH技术的分析方法
这一技术的应用主要是在目标微生物的基础上根据基因的特异性进行排列而成的，在设计的过程中，其中还含有寡核苷酸探针，具有荧光染料的特点，在碱基序列互补性的基础上，只要经过相应的杂交，就会显示出荧光信号，这说明杂交成功，在显微镜的显示下，可以对目的基因加以相对定量分析以及定性分析，在典型的FISH技术中，可以选择具有不同特异性序列的微生物加以检测，这样就可以对微生物群中的结构的变化情况进行研究，从而得出应有的信息。这种方法在污水生物系统中的应用是十分普遍的，并且随着信息技术的发展，这一技术也得到了进一步的完善。
以FISH-MAR技术为例，这一技术是建立在FISH技术基础之上的，因为单独采用FISH技术处理生物代谢等问题还存在一定的局限性，所以在现代化的应用过程中建立起了FISH-MAR技术，这一技术是通过显微照片的形式将生物的复杂性展示出来，清晰的显示出相应的菌群结构以及空间分布等问题，这一技术的核心在于可以在无机底物中加以培养，并且对具有放射性的细胞进行收集，在影像中所呈现出来的颜色是黑色，具体的实验流程是先将适量的污泥加入到血清瓶中，然后在血清瓶中加入适量的放射性标记底物，再经过2h的好氧培养，这样就可以得到污泥样品，将样品固定以后加以冲洗，经过FISH程序与MAR程序以后通过显微镜进行观察，得出相应的结论。
这种方式对微生物代谢与微生物群种结构的研究具有重要的意义，但是不足之处在于对目标含量较低的微生物结构来说并不适用，因为这种方式需要建立在荧光信号以及放射自显影的基础上，所以在活性污泥中，如果目标微生物的细胞过低，那么就会造成目标微生物的rRNA也具有较低的含量，这样就会对荧光信号产生一定的影响，不能得到正常的显影，进而无法准确的检测出结果。因此，如果硝化菌群无法呈现出优势菌群的特征时，那么就不适合采用FISH-MAR这一技术，即便是使用了这一方法，也无法获得显著的效果。
2基于PCR技术的分析方法
2.1amoA与16SrRNA基因
在应用这一技术的过程中，主要是选择具有进化标记的硝化菌群中的DNA序列进行研究，在这一序列的基础上，可以得知x择的分子标记基因为16SrRNA基因以及amoA。在对其进行研究的过程，这一技术所产生的影响是十分深远的，对于不同的微生物而言，16SrRNA在区域中所具有的差异也是十分明显的，其中可以分为两个组成部分，一个组成部分是古细菌，一个组成部分是细菌，在此基础上对微生物开展了更加深入的分析，在进行微生物分析的过程中，发现基因结构也是具有一定差异性影响的，16SrRNA自身具有保守性以及差异性的特点，通过上述的特点可以对系统发育以及相应的进化距离加以进一步的确定。
大部分AOB在分别基于amoA和16SrRNA基因的系统发育树上的分类有着高度的相似性。他们同时也发现，尽管对AOB的16SrRNA基因和amoA基因进行定性分析时都可以反映出环境中AOB的种类，但由于不同种AOB之间的16SrRNA基因序列的高度相似性和该类型引物的非特异性，限制了16SrRNA基因类引物对AOB菌群系统发育树分析的精确度。而尽管amoA不是制定系统发育树的因子，但由于amoA只存在于AOB中，而且不同种AOB的amoA序列差异度超过其16SrRNA基因的序列差异度，使得amoA类引物的扩增特异性更强，因此对AOB菌群遗传差异的分辨能力更高，从而能够更精确地分辩出AOB的种属。但无论是amoA类引物，还是16SrRNA基因类引物，目前都只针对β-变形菌纲的自养型AOB，因此在使用这两类引物对AOB进行分析研究时都会低估环境样品中AOB菌群的多样性。
2.2PCR-T-RFLP
PCR-T-RFLP（PCR-terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-末端限制性片段长度多态性）技术是对PCR扩增过程中所使用的引物一端用荧光物质进行标记。当用该引物对样品DNA进行PCR扩增后，PCR的扩增产物就带有了荧光标记。然后选择适当的限制性内切酶对PCR产物进行消化，就可产生不同长度的限制性片段。传统的T-RFLP技术通常只使用一条带有荧光染料的引物和一种限制性内切酶。随着该技术的改进，有的研究者会同时使用两条带有不同荧光染料的引物进行PCR扩增，从而提高目标微生物的分类水平。最后利用DNA自动测序仪和带有其它荧光染料标记的内标物对消化产物的长度进行分析，并获得峰值图。由于每种微生物带荧光标记的限制性片段长度唯一，所以峰值图中每一个峰至少代表一种微生物，每个峰面积与峰总面积的比值代表这种微生物的相对含量。相对于PCR-DGGE技术，PCR-T-RFLP技术能在相对较短的时间内对大量样品的菌群结构进行分析。PCR-T-RFLP技术还具有较好的重现性和更高的灵敏度，从而该技术能够对样品中含量较少的微生物进行研究。
3结论与展望
分子生物技术在污水生物处理系统内硝化菌群研究中的应用，从微生物学角度更本质地揭示了影响污水生物处理系统硝化性能的因素。本文提到的分子生物技术在污水处理中脱氮除磷相关机理和理论的研究中也有着广阔的应用前景，如短程脱氮、反硝化除磷、同步硝化反硝化及厌氧氨氧化等。通过这些技术可以识别特定生物代谢过程的微生物种群；建立目标菌群动态变化与工艺运行参数之间的相关关系；从微生物学角度对系统运行状态给予最直接、最可靠的分析与证明，为污水生物脱氮除磷系统的长期稳定运行奠定理论基础，提供借鉴与指导。
参考文献