题目：表观遗传学调控NK细胞分化及功能的研究进展
表观遗传学(epigenetics)是指在基因核苷酸序列不发生变化的情况下,通过对转录表达的调控和转录后的调控使基因表达发生变化,包括DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色质重塑、基因印记、及非编码RNA、微小RNA(miRNA)、反义RNA转录后调控等[1]。环境、年龄改变、压力、疾病状态等,均可以引起免疫细胞表观遗传学改变,造成免疫系统功能紊乱,导致疾病的发生与进展。因此,表观遗传学逐渐成为免疫学研究的热点。
自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK)是天然免疫细胞,主要来源于造血干细胞,全身广泛分布。NK细胞通过一系列细胞生物学过程获得激活信号,包括胞外钙离子内流、细胞骨架重排以及与靶细胞接触部位免疫突触形成,最终通过分泌细胞因子、趋化因子及释放毒性颗粒执行清除病毒、肿瘤细胞以及发挥免疫调节功能。NK细胞功能异常导致多种疾病发生,包括感染、肿瘤及自身免疫疾病[2,3]。近年来,有很多学者先后报道了表观遗传学改变对NK细胞增殖、分化及功能的影响,为NK细胞研究提供了新思路,为新药的临床应用奠定了理论基础。本文对NK细胞的表观遗传学研究进展作一综述。
1表观遗传学对NK细胞分化的影响
人类NK细胞表面特异性表达CD56或CD16分子,根据其表达水平将NK细胞分为CD3-CD56brightCD16-(CD56bright)、CD3-CD56dimCD16+(CD56dim)、CD3-CD56-CD16+3个亚群[4]。其中CD56bright亚群为调节性NK细胞,可以参与适应性免疫调节,通过分泌细胞因子和趋化因子(IFN-、TNF-、IL-10、IL-13和GM-CSF)对树突状细胞(DCs)、调节性T细胞(Tregs)、辅助性T细胞(Ths)及细胞毒性T细胞(CTLs)等进行免疫调控[5]。在类风湿关节炎中,NK细胞可以通过分泌IFN-诱导B细胞活化,促进DC细胞成熟,并可抑制T细胞向Th17细胞分化[6]。NK细胞分泌IFN-可以促进DC细胞分泌IL-27,而IL-27可促进IFN-分泌,这种正反馈参与抑制Th17介导的自身免疫疾病[7]。人和小鼠NK细胞均可通过分泌IFN-可以抑制CD4+T细胞向Tregs分化[8]。CD56dim为功能性NK细胞,通过穿孔素/颗粒酶途径、Fas/FasL途径、TNF-а/TNFR-1途径、以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)完成对靶细胞的直接杀伤。近期也有研究者发现,功能性NK细胞参与适应性免疫的调节,直接杀伤适应性免疫细胞,如Th17及滤泡辅助性T细胞(Tfh)[9]。而CD3-CD56-CD16+亚群目前研究较少,目前认为主要发挥ADCC作用。
表观遗传学修饰在NK细胞的分化、成熟中发挥了重要作用。早期的研究显示,IL-15受体信号通路对NK细胞的分化成熟至关重要,E4BP4(NFIL3)在其中发挥调节作用,促进了造血干细胞(HSC)向NK细胞分化。动物实验显示,E4BP4基因缺陷小鼠NK细胞减少、功能下降,而过表达E4BP4可增加Id2和Gata3的转录,从而促进HSC向NK细胞分化增加[10]。在NK细胞发育中,组蛋白甲基化也具有重要调控作用。Yin等[11]研究了zeste基因增强子同源物2(EZH2)对早期NK细胞分化的影响。EZH2作为重要的表观遗传修饰酶,是PcG(polycombgroup)蛋白家族的重要成员,在调控基因表达的过程中起关键作用[12]。EZH2主要对组蛋白H3K27进行甲基化,从而沉默下游基因,在细胞增殖、分化及肿瘤形成方面都有重要作用[13]。研究者[11]发现,在小鼠及人中,选择性失活EZH2或用小分子抑制其活性后,可以增加IL-15受体(CD122+)阳性的NK祖细胞数量,并促进成熟NK细胞增殖。NK细胞的扩增及杀伤作用还与CD122及NKG2D有关,NKG2D缺失可降低EZH2抑制剂对促进NK细胞增殖及分化的作用。另外,Tsuyama等[14]研究报道,NKT细胞淋巴瘤患者存在组蛋白去甲基化酶KDM6A基因突变,此基因与血液肿瘤关系密切,可能影响NK细胞的增殖。
FcRIIIA(CD16a)由FCGR3A编码,为NK细胞在成熟过程中获得。研究发现,在CD16a+细胞中,FCGR3A启动子中转录起始位点的甲基化水平较CD16a-细胞和中性粒细胞明显降低。此外,研究者还发现miR-218是NK细胞CD16a转录后的负调控因子。在NK细胞中过度表达miR-218可降低CD16a的mRNA和蛋白表达水平,miR-218在CD16a-细胞中水平明显高于CD16a+细胞。因此,研究者推断,FCGR3A的转录起始位点甲基化及转录后miR-218的调控作用可以通过改变CD16a的表达来调节NK细胞的分化成熟[15]。
记忆性NK细胞的概念由Sun等[16]最早提出。这类NK细胞可以长期存活,具有免疫记忆功能,当再次接触到记忆抗原时被激活。多种病毒可以诱导记忆性NK细胞产生,目前报道的有巨细胞病毒,单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒等[17,18]。记忆性NK细胞表达CD57和NKG2C,不表达FcR、SYK、DAB2、ETA-2、PLZF和ILZF2。FcR、ETA-2、SYK的缺乏均有表观遗传学机制的参与[19,20]。IL-12信号通路通过其下游转录因子信号和转录因子4(STAT4)的激活影响记忆性NK细胞的扩增。Rapp等[21]发现Runx1和Runx3的启动子区域是STAT4的结合位点,在NK细胞活化过程中,STAT4的结合会诱导RUNX基因位点的表观遗传学修饰,从而导致表达增加。在病毒感染中,Runx1和Runx3或它们的伴侣分子表达减低是影响NK细胞扩增及记忆NK细胞形成障碍的原因。该研究证明,STAT4介导的Runx转录因子表观遗传学修饰可以调节NK细胞对病毒的适应行为。
2表观遗传学对NK细胞功能的影响
NK细胞的功能主要包括杀伤及免疫调节作用。有研究显示,在NK细胞活化过程中,81%的主要位点出现CpG去甲基化,生物学分析显示差异甲基化位点主要集中在免疫调节功能中(如TNFA、LTA、IL-13、CSF2等)[22],这提示表观遗传学修饰参与了NK细胞的活化,并与NK细胞功能关系密切。
2.1表观遗传学修饰对NK细胞表面受体的调节作用
NK细胞表面激活性受体与抑制性受体的相互平衡,在NK细胞功能中发挥了重要调节作用。如激活性受体表达占优,则NK细胞活化,反之,NK细胞处于静止状态。
有学者[23,24,25]检测了NK细胞免疫球蛋白样受体(KIR)启动子的甲基化水平,结果发现,处于静息状态的人NK细胞92细胞系中KIR2DL1、KIR2DL2/L3高甲基化,同时,细胞表面的KIR表达降低。当应用5-氮杂胞苷进行去甲基化处理后,KIR启动子去甲基化,NK细胞表面KIR表达明显增加。另外,KIR的表达受miRNA调节。PIWI样RNA可以诱导KIR双向启动子KIR3DL1产生KIR反义转录本,影响双链DNA的合成,可减少90%的KIR表达[25]。
NKG2D是NK细胞激活性受体,其表达增加可增强NK细胞功能。NKG2D通过识别不同的配体家族(MICA、MICB、ULBPs1-6等)参与激活效应细胞、溶解靶细胞。NKG2D基因在NKG2D+NK细胞中去甲基化,并与组蛋白H3赖氨酸9乙酰化(H3K9Ac)相关。用组蛋白乙酰转移酶(HAT)抑制剂(姜黄素)可以明显下调NKG2D基因H3K9乙酰化水平,进而下调NKG2D的转录,导致NKG2D表达减低,NK细胞杀伤功能下降。此研究提示NKG2D在NK细胞表面表达差异是由表观遗传学机制调节的,并可以通过表观遗传治疗改善[26]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)通过激活基因启动子中组蛋白K9的高甲基化和DNA甲基化,从而下调NKG2D的表达[27]。同样,miRNA也可发挥对NKG2D的调节作用。在HCV感染患者的NK细胞中,miR-182与对照组相比过表达,miR-182表达升高可降低NKG2D的mRNA水平,而miR-182抑制剂能降低抑制性受体NKG2A的mRNA水平[28]。
2.2表观遗传学修饰对NK细胞细胞因子分泌水平的调节作用
NK细胞分泌细胞因子同样受到表观遗传学修饰的调节。Luetke-Eversloh等[29]报道,NK细胞受到刺激后,IFN-及T-bet位点转录增加,并发生去甲基化,从而增加IFN-的分泌。Li等[30]发现,在NK细胞激活过程中,组蛋白去甲基化酶及甲基转移酶发生明显变化。在NK92细胞系中,与NK细胞激活密切相关的PI3KCA,、NFATC1及TNFSF9等基因,经PMA和依诺霉素刺激可出现H3K4me3和H3K27甲基化修饰,从而调控上述基因表达。采用H3K4和H3K37的特异性抑制剂可以增加NK细胞脱颗粒及IFN-、TNF-的分泌[22,30]。Cribbs等[31]用染色质甲基化及乙酰化的小分子抑制剂进行筛选,并通过基因敲除方法确定了Jumonli型组蛋白H3K27脱甲基酶是NK细胞分泌细胞因子的关键调节因子。JMJD3/UTX(含有Jumonji结构域的蛋白3)H3K27去甲基化酶抑制剂GSK-J4可引发细胞因子转录起始位点H3K27甲基化,并造成NK细胞IFN-、TNF-、GM-CSF、IL-10分泌下降。GSK-J4可以明显抑制类风湿性关节炎患者外周血或组织中分离出的NK细胞的细胞因子分泌,抑制破骨细胞形成及骨破坏。除甲基化外,组蛋白乙酰化修饰也对NK细胞细胞因子分泌起调节作用。VPA可抑制NK细胞对白血病细胞的溶解,并且有剂量依赖性。VPA预处理可降低NK细胞IFN-分泌,破坏CD107A脱颗粒,并通过激活PD-1/PD-L1途径诱导细胞凋亡[27]。
H3K4me3脱甲基酶KDM5A调节基因转录并参与肿瘤的发生。Zhao等[32]研究证明KDM5A缺陷使IFN-产生减少,并损害NK细胞的活化。KDM5A(-/-)小鼠对单核细胞增生李斯特氏菌(LM)感染高度敏感。在NK细胞活化过程中,KDM5A的缺失影响STAT4磷酸化和核定位,并增加了细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)的表达。进一步研究揭示其机制为KDM5A与P50结合,并与静止NK细胞中的SOCS1启动子区结合,抑制染色质重塑,导致在SOCS1启动子中H3K4me3修饰显著减少。
另外,Lee等[19]在研究记忆性NK细胞时发现,人巨细胞病毒感染后,NK细胞Syk转录起始位点甲基化,Syk基因沉默,可引起表达IFN-水平升高。BHLHE40为转录调节因子,在活化的NK细胞中去甲基化,诱导细胞因子分泌(如IL-2、IL-12、IL-15、IFN、TNFA等),增强NK细胞功能。NFAT转录因子家族通过与启动子及增强子区域结合来增加NK细胞因子的表达。在活化的NK细胞中,NFATC1内含子9明显去甲基化,可调节NK细胞分泌细胞因子[22]。
3引起NK细胞表观遗传学变化的因素
多种疾病状态下,NK细胞的表观遗传学修饰会发生变化,如巨细胞病毒感染会激活NK细胞,引起81%的位点发生DNA去甲基化[22]。在儿童哮喘患者中,NK细胞DNA去甲基化,引起NK细胞活性升高[33]。在类风湿关节炎及强制性脊柱炎中,NK细胞均存在表观遗传学改变[31,32,33,34]。
一些药物可以引起NK细胞的表观遗传修饰变化。Misale等[35]报道,糖皮质激素可以通过影响H3K27me3来降低IFN-的表达,从而抑制NK细胞的免疫功能。5-氮杂胞苷可引起NK细胞DNA去甲基化,诱导相关基因激活,促进NK细胞活化[36]。
运动也可以引起NK细胞表观遗传学修饰发生改变。Zimmer等[37]选取30例非霍奇金淋巴瘤患者及10名健康人,干预组每人每天骑车运动30min。运动组的患者血清巨噬细胞游走抑制因子(MIF)及IL-6水平升高,NK细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平降低。近期,研究者再次证明运动可以通过升高组蛋白乙酰化水平及NKG2D的表达,改善正常人NK细胞活化状态[38]。
压力及年龄的增长对NK细胞的表观遗传学也有明显影响。创伤后应激综合征可以加速NK细胞由年龄造成的甲基化水平升高,从而影响机体免疫状态[39]。
综上所述,表观遗传学修饰影响着NK细胞的增殖、分化、杀伤、免疫调节等,在NK细胞调控中,扮演重要角色。但目前,NK细胞表观遗传学研究多集中在基础实验阶段,在临床疾病中的应用很少。NK细胞参与肿瘤、自身免疫疾病及感染的发病,其异常是否与表观遗传学修饰有关?进一步研究NK细胞表观遗传学异常在疾病发生中的作用,将基础研究向临床应用转化,开拓疾病中NK细胞功能异常的新思路,并为新型药物在临床中的应用提供研究基础,将是本课题组今后努力的方向。
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关键词：静态调度；公共交通系统；免疫遗传算法
中图分类号：G650文献标识码：A文章编号：1003-2851（2012）-09-0180-01
遗传算法[（geneticalgorithm，GA）是一种自适应大规模并行搜索优化算法，较以往传统的搜索算法具有使用方便、鲁棒性强、便于并行处理等特点，因而广泛应用于解决搜索和优化的问题。但由于遗传算法不能很好地维持解种群中个体的多样性，易趋于“早熟”收敛而陷入局部最优解。因此，遗传算法不能保证一定能找到问题的全局最优解，目前公交公司各车队的排班主要依靠工作人员的经验手工进行，虽然它具有一定的实用性，但它存在着明显的不足，很难保证排班的结果在运营效率等方面是最优或者接近最优的。为满足实际应用需求，采用智能化算法来求解车辆调度优化问题，在有限的算法步骤内，找出所有满足约束条件的排班方案中的最优方案或接近最优的方案。
一、遗传算法
1.遗传算法简介
遗传算法（GeneticAlgorithms，GA）是一种基于自然选择和基因遗传学原理的自适应全局优化概率搜索方法。它的创立有两个研究目的：一是抽象和严谨地解释自然界的适应过程；二是为了将自然生物系统的重要机理运用到工程系统中。GA从许多点开始并行操作，在解空间进行高效启发式搜索，因而可以有效地防止搜索过程收敛于局部最优解；遗传算法在计算机上模拟生物的进化过程和基因的操作，通过目标函数来计算适配值，并不需要对象的特定知识，它具有全局寻优的能力，能解决高度复杂的问题，被广泛应用于自动控制、图形处理、电力调度等方面。
2.建立调度的数学模型
调度系统所采用的数学模型对运行环境做了简化：车的速度恒定，保持匀速行驶，无特殊事件发生；以分钟作为最小的时间单位，这对安排时刻表是合理的；假设客流模型能反映该段线路上的日常客流量（我们假设到站乘客服从均匀分布，在不同时段有不同的分布密度）。
首班车发车时刻为早上6点整，末班车发车时刻为22点整，所有运营车都在整分钟时刻发车，一天之内的总班次为m，总时间为16小时，即960分钟。用xm表示第m辆运营车发车时刻距首发时刻的时间，以分钟为单位。决策变量为X=[x1，x2，…xn]；染色体X是一个完整的发车时刻表，其中的每个基因为一个车辆的发车时刻。
免疫算法效仿生物免疫系统，把外来侵犯的抗原和免疫产生的抗体分别与实际求解问题的目标函数以及问题的解相对应，生成的抗体能有效地排除抗原，也就相当于求得了问题的最优解；对与抗原亲和力高的抗体进行记忆能促进快速求解。
二、IGA应用于公交动态调度
现仍采用上面建立的数学模型，初始规模N仍为200且不随进化代数而发生变化，便于IGA和GA比较。现利用IGA来进行优化的步骤为：
1.在解空间内随机生成初始群体，并计算其适应度，确定最优个体x0best，并给出的取值？滓0，A取为1，？滓0i取为3，？滓？孜取为0。
2.根据式（4.7）进行进化操作，在解空间内生成子代群体，规模为N。
3.计算子代群体的适应度，确定最优个体xt+1best，若f（xt+1best）>f（xtbest），则选定最优个体为xt+1best，否则最优个体为xtbest。
4.重复执行步骤2和3，直至达到终止条件，这里T取为100，选择最后一代的最优个体作为寻优的结果。
本文在遗传算法的基础上采用了一种较新的混合遗传算法——免疫遗传算法对公交静态调度进行了研究，并对二者的应用结果进行了仿真和比较，结果表明IGA有效的克服了简单GA的不足之处，并提高了寻优过程当中目标函数的收敛速度，并得到了合理的发车时刻表，可以提高公交企业的服务水平，对改善城市交通问题和节约市民出行时间有相当的实际意义。
参考文献
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1幽门螺杆菌（HP）
HP是公认的慢性活动性胃炎的致病菌，是消化性溃疡重要的致病因子，并与胃癌及胃粘膜相关的恶性淋巴瘤密切相关。通过PCR检测及细菌培养发现ROU同样有大量HP的存在，其形态学、生化特性、免疫特性与胃粘膜HP相似[2]。又通过72例ROU患者口中不同牙位，龈上、龈下菌斑进行HP-PCR检测，其中轻型43例，疱疹样23例，重型6例，HP阳性率分别为53.49%、56.52%和83.23%。结果表明HP阳性率随着溃疡程度的加重而增高，HP与ROU有着密切不可分的联系。故抗HP治疗是治疗ROU的一种有效方法。
2EB病毒（EBV）
PCR法对13例ROU口腔损害检测中，有5例检测出EBV-DNA。为检测EBV是否同时存在于外周血中，从PCR阳性患者中取2例外周血淋巴细胞及3例浆细胞中检测到EBV-DNA，提示淋巴细胞可能EBV潜伏感染的贮留地。EBV-DNA，EB核抗原，EBV/C3d受体出现在部分基底及基底周围细胞血管内及固有层淋巴细胞核中，提示溃疡前期的上皮细胞可能通过感染EBV的淋巴细胞而受到感染[3]。
3免疫因素[4]
此项研究对唾液中6个指标，血中细胞免疫的8个指标，体液免疫的7个指标，微量元素的5个指标，应用非条件回归分析法，进行综合研究分析。明确提出ROU众多复杂致病因素中，EXRFE、T8、血液LGA、Cu是致病的危险因素，而b淋巴细胞、血清Zn、唾液C3和体液中LYZ则是重要的保护因素。ESRFE每增加一个等级，溃疡发病危险性增加14倍，T8每增加一个等级，溃疡危险性增加3倍。
这2个高危免疫指标的出现，使免疫活性细胞亚群不平衡及免疫活性细胞功能缺陷，导致机体免疫调节紊乱而致口腔溃疡。
4微量元素
血液中的微量元素Zn和Fe呈现保护效应，而Cu为危险因素，Cu/Zn比值表现明显的危险效应，提示缺Zn，高Cu是口腔溃疡发病的重要因素，同时为ROU的治疗找到了依据[4]。
5血液流变学
检测血液流变学指标，结果发现血浆粘度、全血高切还原粘度、红细胞刚性指标及红细胞聚集指数和ROU有密切关系。血液流变学的这些指标改变引起全血血浆粘度升高，血流速度减慢，有利于t淋巴细胞的浸润和免疫活性物质如粘附分子、免疫球蛋白及细胞因子的浸出，使它们能够介导与口腔黏膜发生特异性的免疫反应，引起一系列自身免疫反应，最终导致口腔溃疡的发生[5]。
6细胞遗传学
应用现代细胞遗传技术，文献报道60名ROU患者中40名有家族遗传史。对外周血淋巴细胞的SCE、微核发生率、染色体畸变进行研究，与正常对照组相比，均有极显著性差异。因此ROU患者可能先天即有DNA修复缺陷和固有的不稳定染色体结构，这与疾病的发生存在一定的因果关系[4]。
7雌孕激素受体
应用ABC法对10例健康女性黄体期口腔黏膜作ER和PR的检测，结果7例雌激素受体阳性，8例孕激素受体阳性，证明了口腔黏膜亦是性激素的靶器官之一，正常的性激素受体数量及功能状态是口腔黏膜促使正常生理功能的重要保证，倘若性激素受体数量和功能状态发生改变，或者性激素的分泌出现异常，均可导致口腔黏膜发生病理变化。此项研究有助于阐明性激素受体改变相关的口腔黏膜病的发病机理，进而通过调节性激素受体及其性激素水平达到治疗目的[6]。
ROU为人群中的常见病、多发病，治疗后复发率较高。因此，ROU的诱发因素至关重要，通过对幽门螺杆菌、EBV、微量元素、雌孕激素受体的检测，对免疫学、血液流变学、遗传学等研究，发现了与致病相关的因素，从而为临床诊治提供了依据。因此，应用抗HP、抗病毒、抗免疫，调节性激素和血液流变学，加适量微量元素，注意遗传因素，将是治疗ROU的最佳方案。
参考文献
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[2]陈发明，贾保军，孙海龙等.复发性口腔溃疡和消化性溃疡患者口腔及胃粘膜中的幽门螺杆菌[J].牙体、牙髓、牙周病杂志，2009，19（2）：75.
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